【摘要】：研究背景腹膜透析(Peritonealdialysis,PD)是終末期腎病患者腎臟替代治療的主要方式之一,腹透相關(guān)性腹膜炎(Peritoneal Dialysis Associated Peritonits,PDAP)是腹膜透析治療常見的嚴(yán)重并發(fā)癥。近年提出的PDAP短期預(yù)后不良直接影響PD患者的生存和技術(shù)生存,目前國內(nèi)缺少該領(lǐng)域的研究。鼻腔應(yīng)用抗生素改善鼻腔帶菌狀態(tài)可有效降低PD導(dǎo)管相關(guān)感染的發(fā)生率,但因?yàn)榭股氐挚古R床推廣困難,目前尚無新的替代方法。PDAP影響腹膜結(jié)構(gòu)與功能的機(jī)制研究受腹膜活檢取材困難的限制,外泌體是活細(xì)胞主動(dòng)分泌的結(jié)構(gòu),具有無創(chuàng)活檢的優(yōu)勢(shì),但缺乏腹透液外泌體的提取方法及應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)。炎癥通過改變免疫細(xì)胞及實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)導(dǎo)致纖維化,但具體機(jī)制尚不清楚,已發(fā)現(xiàn)糖酵在IL1β誘導(dǎo)的腎臟纖維化,但對(duì)間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用尚待觀察。本研究回顧性分析PDAP短期預(yù)后不良及危險(xiǎn)因素,初步觀察鼻前庭定植菌管理對(duì)PDAP發(fā)生率的影響。同時(shí)嘗試建立腹透液外泌體的提取方法,應(yīng)用外泌體技術(shù)觀察PD患者的炎癥狀態(tài),細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步觀察IL1β誘導(dǎo)的人腹膜間皮轉(zhuǎn)分化過程中的糖酵解。研究目的1.觀察腹透相關(guān)性腹膜炎的臨床特征和危險(xiǎn)因素,分析其對(duì)腹膜透析患者生存及技術(shù)生存的影響;2.觀察腹透相關(guān)性腹膜炎的臨床預(yù)后及短期預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素;分析高頻腹膜炎的危險(xiǎn)因素及長期生存與技術(shù)生存;3.建立超速離心法提取腹透液外泌體的方法,初步評(píng)價(jià)腹膜透析患者的炎癥狀態(tài),觀察IL1β誘導(dǎo)的糖酵解與人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)系。研究方法第一部分腹透相關(guān)性腹膜炎危險(xiǎn)因素及預(yù)后分析采用回顧性隊(duì)列研究的方法,納入2004年1月1日至2017年3月31日在北京協(xié)和醫(yī)院腹膜透析中心開始接受腹透治療的成年終末期腎臟病患者,收集基線一般資料、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和腹膜透析相關(guān)指標(biāo)�！ひ话阗Y料:人口學(xué)資料、臨床粥樣硬化性血管疾病等合并癥、查爾森合并癥指數(shù);·實(shí)驗(yàn)室指標(biāo):血常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)等生化指標(biāo)、hsCRP或NLR等炎癥指標(biāo)、ALB、HbA1c、UA、SI等營養(yǎng)及代謝指標(biāo)�！じ鼓ね肝鱿嚓P(guān)指標(biāo):透析充分性、腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)、標(biāo)準(zhǔn)蛋白分解率、是否發(fā)生腹透相關(guān)性腹膜炎及其臨床特征;·其他:腹膜炎患者收集發(fā)生腹膜炎前3月內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及透析相關(guān)指標(biāo)。1.隨訪截止至2018年3月31日,以死亡為主要終點(diǎn),技術(shù)失敗為次要終點(diǎn),記錄患者的轉(zhuǎn)歸及原因。比較腹膜炎、無腹膜炎患者臨床特征及長期生存,使用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率、技術(shù)生存率,應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響腹膜透析患者生存和技術(shù)生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;2.首次腹膜炎后隨訪4周截止至2017年4月30日,觀察短期預(yù)后即4周內(nèi)出現(xiàn)死亡、拔管轉(zhuǎn)血液透析、持續(xù)性感染或復(fù)發(fā)的患者歸入腹膜炎短期預(yù)后不良組,其余歸入短期預(yù)后良好組,比較兩組患者基線、腹膜炎發(fā)生前3月臨床特征,Logistic回歸模型分析腹膜炎短期預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素;3.對(duì)首次腹膜炎后存活且繼續(xù)腹膜透析的腹膜炎患者,隨訪至2018年3月31日根據(jù)隨訪期內(nèi)腹膜炎發(fā)生率的高低分為高頻腹膜炎組(腹膜炎發(fā)生率0.5次/患者年)、低頻腹膜炎組。觀察鼻前庭定植菌檢測(cè)及干預(yù)對(duì)腹膜炎發(fā)生率的影響,分析高頻腹膜炎對(duì)患者腹膜功能及長期生存的影響。第二部分腹透液外泌體評(píng)價(jià)腹膜炎癥狀態(tài)方法建立及意義初探1.建立超速離心法提取腹透液外泌體的方法收集新鮮的腹透液,參考漿膜腔積液外泌體及本實(shí)驗(yàn)室尿液外泌體提取方法,嘗試調(diào)整原液量、離心條件、應(yīng)用濾器等因素,提取腹透液外泌體。對(duì)所提取樣品進(jìn)行負(fù)染色、透射電鏡鏡檢觀察形態(tài);納米顆粒跟蹤分析技術(shù)檢測(cè)樣品中外泌體濃度及粒徑分布;Western Blot法鑒定外泌體特異性標(biāo)志物TSG101及CD63蛋白的表達(dá),以鑒定外泌體提取是否成功。2.腹膜透析患者腹腔炎癥狀態(tài)初步觀察反復(fù)離心法提取規(guī)律腹膜透析患者腹透液原代巨噬細(xì)胞,倒置顯微鏡觀察其形態(tài),免疫熒光CD68染色鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物;免疫熒光法檢測(cè)腹透液原代巨噬細(xì)胞NLRP3,Caspase1和IL1β的表達(dá)。收集2017年1月1日至2018年1月31日腹透相關(guān)性腹膜炎患者的腹透液、臨床資料,按照年齡、透析齡匹配無腹膜炎的常規(guī)腹透患者,比較兩組患者的臨床特征,ELISA法測(cè)定腹透液IL1β;提取腹透液中的外泌體,Western Blot法檢測(cè)兩組患者腹透液外泌體NLRP3,Caspasel,IL1β及糖酵解通路酶水平。3.糖酵解參與IL1β誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的初步觀察DMEM/F12培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞株(HMrSV5),形態(tài)學(xué)及免疫熒光法鑒定pan-Cytokeratin陽性,確認(rèn)其具有腹膜間皮細(xì)胞的特征。不同濃度的IL1β與細(xì)胞共孵育,CCK-8、LDH釋放試驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞增殖與毒性,選擇合適濃度的IL1β用于后續(xù)試驗(yàn)。比色法檢測(cè)對(duì)照組和IL-1β刺激組細(xì)胞乳酸分泌量及細(xì)胞內(nèi)ATP水平;免疫熒光及Western Blot法評(píng)估糖酵解通路關(guān)鍵酶Hexokinase Ⅱ、LDHA的水平,Western Blot檢測(cè)α-SMA、波形蛋白(vimentin)、緊密連接蛋白Claudin1、纖連蛋白(Fibronectin,FN)的蛋白水平,評(píng)價(jià)IL1β對(duì)間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的作用。研究結(jié)果1.腹透相關(guān)性腹膜炎危險(xiǎn)因素及對(duì)長期技術(shù)生存的影響本中心553例腹膜透析患者中162例患者發(fā)生大于等于一次PDAP,腹膜炎發(fā)生率每77患者月1次。腹膜炎患者男女比例79:83,開始腹膜透析時(shí)平均年齡(58.5±15.7)歲,原發(fā)病主要為糖尿病腎病(34.0%)和慢性腎小球腎炎(16.0%)。發(fā)生腹透相關(guān)性腹膜炎時(shí)患者的平均年齡(61.0±15.9)歲,發(fā)生腹膜炎時(shí)中位腹膜透析時(shí)間為20.5(5.0,44.0)月,感染腹透液微生物培養(yǎng)陽性率56.8%,其中最常見致病菌為革蘭氏陽性球菌(57.6%)。Logistic回歸分析顯示,合并臨床粥樣硬化性血管疾病(OR= 1.827,95%CI 1.138-2.934,P=0.013)、應(yīng)用 Tenckhoff 管(OR=2.101,95%CI 1.022-4.319,P=0.044)是發(fā)生腹透相關(guān)性腹膜炎的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本中心腹透患者中位生存時(shí)間為67.0(60.1-73.9)月,Kaplan-Meier生存分析及Log Rank檢驗(yàn)提示腹膜炎患者技術(shù)生存率顯著低于無腹膜炎患者(χ2=10.753,P=0.003),生存率沒有差異。多因素Cox回歸模型顯示,非老年(HR=1.903,95%CI 1.014-3.572,P=0.045)、高 BMI(HR=1.089,95%CI 1.013-1.172,P=0.022)、腹透相關(guān)性腹膜炎(HR=2.738,95%CI 1.552-4.829,P=0.001)是影響腹膜透析患者長期技術(shù)生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。2.微炎癥狀態(tài)對(duì)腹透相關(guān)性腹膜炎的短期預(yù)后的影響162例腹透相關(guān)性腹膜炎患者中,55例(34.0%)發(fā)生短期預(yù)后不良,其中30.9%患者拔管轉(zhuǎn)血液透析,29.1%的患者死亡,致病菌均以革蘭氏陰性菌為主。與預(yù)后良好患者相比,短期預(yù)后不良患者發(fā)生合并臨床粥樣硬化性血管疾病的比例更高(49.1%比31.8%,P=0.031),發(fā)生腹透相關(guān)性腹膜炎前3月hsCRP水平升高(9.3mg/dl比3.6mg/dl,P=0.004),多種微生物和革蘭氏陰性菌感染比例更高(15.6%比3.3%,P=0.039)。Logistic 回歸分析顯示,腹透齡1 年(OR=2.324,95%CI 1.080-5.003,P=0.031)、腹膜炎前高 hsCRP(OR=1.027,95%CI 1.002-1.052,P=0.031)是腹膜透析患者發(fā)生腹膜炎短期不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。3.鼻前庭定植菌檢測(cè)及干預(yù)降低高頻發(fā)作腹膜炎、改善長期預(yù)后129例首次腹膜炎后繼續(xù)腹透患者中,高頻腹膜炎患者50例(38.8%),行鼻前庭定植菌檢測(cè)及干預(yù)的比例顯著低于低頻腹膜炎組患者(70.0%比87.3%,P=0.015)。其他基線資料方面,除血尿酸較高、血CA125較低外,原發(fā)病類型、基線實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)類型及腹透充分性指標(biāo)與低頻腹膜炎組無顯著差異。隨訪至終點(diǎn)事件前,高頻組患者4小時(shí)D/P肌酐顯著高于低頻組患者(0.74±0.11比0.68±0.10,P=0.005),相應(yīng)的腹膜高轉(zhuǎn)運(yùn)的患者比例顯著高于低頻組(22.7%比10.3%,P0.017)。生存分析結(jié)果表明,高頻腹透相關(guān)性腹膜炎患者生存率及技術(shù)生存率均顯著低于低頻腹膜炎組(P均0.001),其死亡和拔管的主要原因均為感染。Logistic 回歸模型發(fā)現(xiàn),基線血 UA 升高(OR=1.040,95%CI 1.008-1.073,P=0.014)是腹膜炎患者發(fā)生高頻腹膜炎的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,行鼻前庭定植菌檢測(cè)及干預(yù)(OR=0.230,95%CI 0.086-0.617,P=0.004)可降低高頻腹膜炎的風(fēng)險(xiǎn)。4.腹透液外泌體評(píng)價(jià)腹膜炎癥狀態(tài)方法建立及意義初探成功建立了超速離心法提取腹透液外泌體的方法,負(fù)染色后透射電鏡觀察到微囊泡結(jié)構(gòu),直徑100nm左右;納米顆粒跟蹤分析結(jié)果樣品中顆粒濃度為4.3×1010/ml;所檢測(cè)顆粒的平均直徑為136.0±61.1nm,直徑為133.0nm的顆粒相對(duì)濃度值最高(2.7×106/ml);Western Blot法檢測(cè)到外泌體標(biāo)志性蛋白TSG101及CD63。免疫熒光法可檢測(cè)到常規(guī)腹膜透析患者腹透液中部分巨噬細(xì)胞(CD68+)同時(shí)表達(dá)NLRP3,Caspase1,IL1β;腹膜炎患者腹透液IL1β水平顯著高于常規(guī)腹透患者[63.3(9.4,67.6)比1.5(1.3,1.6),P=0.004]。兩組患者腹透液外泌體中可檢測(cè)到NLRP3,Caspase1,IL1β,經(jīng)內(nèi)對(duì)照TSG101校正后,腹膜炎患者腹透液外泌體NLRP3,Caspase1蛋白水平顯著高于患者,同時(shí),該組患者糖酵解通路酶HexokinaseⅡ、LDHA蛋白水平顯著升高。5.糖酵解參與IL1β誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的初步觀察根據(jù)細(xì)胞增殖、毒性試驗(yàn)結(jié)果,選擇1ng/ml的IL1β與間皮細(xì)胞共孵育后,比色法測(cè)細(xì)胞分泌乳酸減少、細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生增加,免疫熒光和western-blot證實(shí)細(xì)胞內(nèi)糖酵解相關(guān)的酶Hexokinase Ⅱ、LDHA水平亦較對(duì)照組顯著升高,伴隨間皮細(xì)胞α-SMA蛋白、波形蛋白、纖連蛋白表達(dá)量顯著增加,緊密連接蛋白Claudin1表達(dá)量顯著降低,提示間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。小結(jié)本研究條件下觀察到1.腹透相關(guān)性腹膜炎是影響腹膜透析患者長期技術(shù)生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,但不影響長期生存。開始透析時(shí)合并臨床粥樣硬化性血管疾病、應(yīng)用Tenckhoff管是發(fā)生腹透相關(guān)性腹膜炎的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;2.首次腹膜炎前高h(yuǎn)sCRP和腹透齡大于1年是腹膜炎短期不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,高頻腹膜炎患者生存率和技術(shù)生存更低,隨訪終點(diǎn)時(shí)腹膜高轉(zhuǎn)運(yùn)比例顯著升高,進(jìn)入腹透時(shí)行鼻前庭定植菌管理有助于降低高頻腹膜炎的發(fā)生;3.超速離心法可有效提取腹透液外泌體,腹透患者腹透液中巨噬細(xì)胞和外泌體中可檢測(cè)到NLRP3,Caspase1,IL1β的表達(dá),腹膜炎時(shí)腹透液中IL1β顯著升高,腹透液外泌體中NLRP3,Caspase1表達(dá)上調(diào)。腹膜炎時(shí)腹透液外泌體糖酵解通路酶Hexokinase Ⅱ、LDHA顯著上調(diào),糖酵解途徑可能參與IL1β誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化-纖維化過程。
【圖文】：

診（隨診間期超過２個(gè)月）。患者入組流程圖如圖１．１．１所示。逡逑２００４年１月１日－２０１７年３月３１日逡逑在北京協(xié)和醫(yī)院接受腹膜透析逡逑治療患舍＇逡逑ｎ＝５９４邐邐逡逑病歷資料不完整逡逑邐？邋或未規(guī)律隨診逡逑邐＾邐邋ｎ＝３８逡逑資料完整且規(guī)律隨診邐邐逡逑ｎ＝５５６邐邐逡逑邐邐邋未滿１８周歲逡逑＝

邐中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士研究生論文邐逡逑二、研究結(jié)果逡逑１．本組腹膜透析患者基本情況及基線資料逡逑５５３例納入本研究的ＥＳＲＤ患者開始腹膜透析時(shí)平均年齡５７．９±１６．６歲，中位逡逑年齡６１．０（邋４６．５，７１．０邋）歲，女性患者４７．９％。原發(fā)病最常見為糖尿病腎�。玻埃袄ǎ常叮玻ィ�，逡逑其次為慢性腎小球腎炎（１５８例，２８．６％）和高血壓腎損害（１２２例，２２．１％）（如圖逡逑１．１．２Ａ）。２４３例患者合并糖尿病，占４３．９％，而合并臨床粥樣硬化性血管疾病者１４６逡逑例（２６．４％，），，計(jì)算基線中位邋ＣＣＩ邋３．０邋（２．０，５．０）。逡逑９３．８％的腹膜透析管為鵝頸管（Ｓｗａｎ－ｎｅｃｋ），維持性腹膜透析方式為ＡＰＤ患者逡逑７７邋例（１３．４％），基線殘余邋ＧＦＲ邋為邋３．３４邋（１．６８，邋５＿４７）邋ｍｌ／ｍｉｎ，中位殘余尿量邋８５０逡逑（５００，１４００）邋ｍｌ，對(duì)應(yīng)中位２４小時(shí)透析超濾量為４０４ｍｌ邋（１３ｍｌ，邋８５０ｍｌ）；基線腹膜逡逑轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)主要為ＨＡ邋（５２．６％）和ＬＡ邋（３１．４％）（如圖１．１．２Ｂ）；基線每周Ｋｔ／Ｖ邋２．３３逡逑（１．９９，２．７６），每周邋Ｃｃｒ７５．８邋（５９．４，９４．０）邋ｍｌ／（ｍｉｎ．ｌ＿７３ｍ２）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R692.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;降低腹膜透析早期技術(shù)失敗率專家共識(shí)[J];中國血液凈化;2013年05期

2 方煒,錢家麒,余志遠(yuǎn),林愛武,陳詩書;腹膜透析對(duì)人腹膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[J];中華腎臟病雜志;2002年06期

本文編號(hào)：2623246