發(fā)布時(shí)間：2020-04-09 03:25

【摘要】：血小板主要用于預(yù)防和治療血小板減少及其功能障礙引起的出血和出血傾向,在臨床發(fā)揮著不可替代的作用。血小板主要來源于無償獻(xiàn)血者,盡管按照國家規(guī)定對其進(jìn)行檢測,但仍存在殘余風(fēng)險(xiǎn)。其一,多種病原體可經(jīng)血液傳播,除了目前已知的經(jīng)血液傳播的病原體如HIV、HBV、HCV、TP等外,還有一些新出現(xiàn)及未知的病原微生物,而檢測項(xiàng)目有限。其二,由于檢測技術(shù)的局限性和“窗口期”的存在等,導(dǎo)致漏檢。如何進(jìn)一步提高異體血小板安全性是人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題,血小板病原體滅活技術(shù)的研究正是為提高異體血小板安全性而生。本實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)了一臺UVC(短波紫外線)滅活裝置,研究發(fā)現(xiàn)UVC照射處理可有效滅活血小板懸液中的偽狂犬病毒和辛德畢斯病毒,但是篩選輻照劑量時(shí)跨度較大,也未對UVC處理后血小板的質(zhì)量做出評估。因此,本研究中,我們著重于輻照劑量的重新篩選以及篩選出的輻照劑量處理血小板對其質(zhì)量的影響,探索在達(dá)到滅活效果的同時(shí)盡量確保血小板的質(zhì)量,具體研究內(nèi)容如下。一、繪制滅活曲線,選取適宜的短波紫外線輻照劑量我們以PRV(偽狂犬病毒,HBV指示病毒)、SNV(辛德畢斯病毒,HCV指示病毒)作為指示病毒,將病毒懸液加入血小板懸液中,兩者的體積比為1:9,經(jīng)一系列輻照劑量處理后,微量細(xì)胞病變法檢測病毒滴度,繪制滅活曲線。實(shí)驗(yàn)觀察到UVC輻照劑量為0.22J/Cm2,PRV減少滴度(4.33±0.28)logs,SNV減少滴度(4.75±0.25)logs,達(dá)到了《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》的要求(病毒降低量log104 logs)。因此我們選取的UVC輻照劑量為 0.22J/cm2,所得結(jié)果與 THERAFLEX UV-Platelets system(Macopharma)相近。二、選取適宜輻照劑量處理血小板,評估滅活后血小板質(zhì)量的變化血小板經(jīng)0.22J/cm2輻照劑量處理,掃描電鏡觀察到UVC照射處理后的血小板外形極不規(guī)則,偽足伸出,這是血小板處于激活狀態(tài)的表現(xiàn)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)觀察到UVC照射處理導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)下降,體積增大(MPV、P-LCR增加),血小板激活標(biāo)志PAC-1、CD62p和凋亡標(biāo)志Annexin V陽性表達(dá)率均升高,HSR下降,ROS生成增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ROS第五天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),UVC照射處理對血小板質(zhì)量有一定的影響。三、UVC處理血小板懸液過程中保護(hù)劑的初步篩選UVC照射處理導(dǎo)致血小板活化、ROS生成增加。因此我們選擇添加血小板活化抑制劑維生素B6、L-Arg和抗氧化劑GSH、NAC、組氨酸,觀察這些試劑是否能減少短波紫外線對血小板的損傷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加300μm L-Arg第三天MPV下降,第五天血小板HSR上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;分別添加0.25mM維生素B6、1mMNAC和1mM組氨酸對血小板血塊收縮、血小板計(jì)數(shù)、MPV、P-LCR、HSR均無明顯保護(hù)作用,亦無明顯損害作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們初步篩選出300μm L-Arg作為保護(hù)劑,但是因?qū)嶒?yàn)標(biāo)本量較少,實(shí)驗(yàn)中用來篩選保護(hù)劑的檢測指標(biāo)不多,因此我們還選擇了 0.25mM維生素B6、1mMNAC和1mM組氨酸,以進(jìn)一步研究其是否能有效保護(hù)經(jīng)UVC處理的血小板的質(zhì)量。四、初篩出的保護(hù)劑對短波紫外線滅活血小板懸液中PRV、SNV效果的影響血小板懸液中加入PRV或者SNV,再加入初步篩選出的保護(hù)劑,然后經(jīng)輻照劑量為0.22J/cm2的UVC照射處理,微量細(xì)胞病變法檢測病毒滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.25mM維生素B6、3000μmL-Arg、1mMNAC、1mM組氨酸均不影響UVC滅活血小板懸液中的PRV、SNV的效果。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)短波紫外線在輻照劑量為0.22J/Cm2時(shí)可有效滅活血小板懸液中的偽狂犬病毒、辛德畢斯病毒;UVC照射處理對血小板質(zhì)量有一定的影響;初步篩選短波紫外線處理血小板懸液過程中的保護(hù)劑;初篩出的試劑對UVC滅活血小板懸液中的PRV、SNV的效果無明顯影響。我們還需更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)以上初篩出的試劑是否能有效保護(hù)經(jīng)UVC處理的血小板的質(zhì)量,以及探索如何在保證病原體滅活效果的同時(shí)盡量確保血小板的質(zhì)量。
【圖文】：

邐第一章邋短波紫外線，

本文編號：2620224