【摘要】：研究背景發(fā)熱伴血小板減少綜合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是一種以發(fā)熱和血小板減少為主要臨床特征的自然疫源性疾病,起初該病多被誤診為人粒細胞無形體病(Human granulocytic anaplasmosis)。2009年于學(xué)杰教授在SFTS患者血清中分離出一種新型布尼亞病毒,才確定該病屬于新發(fā)病毒性疾病,并將該病毒命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus),簡稱 SFTSV。SFTSV屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒屬(Phlebovirus),是分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒,其基因組分為大(L)、中(M)、小(S)三個片段,分別編碼不同的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白。其中M片段編碼的是病毒的包膜糖蛋白前體,該前體在細胞內(nèi)經(jīng)蛋白酶水解作用形成Gn和Gc兩個糖蛋白,并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中加工后轉(zhuǎn)移至病毒包膜和細胞膜上。蜱是SFTSV的傳播媒介和自然宿主,起主要作用的是長角血蜱(Haemaphysalis longicornis),可以通過叮咬將病毒傳播給人類,草地游離蜱的最小感染率(minimum infection rate,MIR)為0.2%～5.4%。另外,其他節(jié)肢動物如小盾纖恙螨(Leptotrombidlum sutellare)、毒棘厲螨(Echinolaelaps echidninus)和牛虻中也有檢測到病毒核酸的個別報道,可能是其傳播媒介。家養(yǎng)動物如羊、牛、狗、雞、豬均可檢測到SFTSV的抗體,但它們是否是SFTSV的擴大宿主尚需調(diào)查。SFTS患者的臨床表現(xiàn)無特異性,會出現(xiàn)與流感相似癥狀,如發(fā)熱、畏寒、乏力、厭食、惡心、眩暈等,實驗室檢查可見血小板減少、白細胞減少、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)升高等。SFTS病程一般分為潛伏期、發(fā)熱期、多器官功能衰竭(MOF)期和恢復(fù)期�；謴�(fù)期患者體內(nèi)可檢測到抗SFTSV特異性IgG抗體,作為感染SFTSV的依據(jù)。目前,我國已有23個省份報告SFTS病例,2011～2014年共報告SFTS病例5352例,主要集中在中東部地區(qū)。此外,日本、韓國和朝鮮也有SFTS的病例報道,病死率普遍較高。SFTS患者主要分布于山地丘陵地帶,一般發(fā)生于4～10月,主要為老年人,絕大部分患者為農(nóng)民。SFTSV亦可通過人-人進行傳播,接觸患者或死者的血液、分泌物或排泄物、氣溶膠可能會發(fā)生感染。SFTSV的致病機制尚不完全清楚。現(xiàn)有研究表明,SFTSV感染會使免疫系統(tǒng)功能紊亂,各種細胞因子會產(chǎn)生不同程度的升高或降低,可能與疾病進展相關(guān)。目前,主要的動物模型有Ⅰ型干擾素受體敲除(IFNAR-/-)小鼠、新生小鼠和絲裂霉素處理的小鼠,這些小鼠感染SFTSV后可以產(chǎn)生不同程度的與人類相似的臨床癥狀或死亡,應(yīng)用動物模型可以更好地研究SFTSV在體內(nèi)產(chǎn)生的病理改變。脾臟是公認的SFTSV感染最嚴重的器官�；颊咧委煼矫婺壳爸荒芤詫ΠY治療和支持治療為主,尚無治療SFTS的特效藥物和疫苗,因此疾病預(yù)防至關(guān)重要,最主要的預(yù)防措施是避免蜱蟲叮咬,并加快疫苗的研制。人體感染病毒后,體內(nèi)一般會產(chǎn)生不同水平的保護性免疫。中和抗體可以特異性結(jié)合入侵的病毒,保護人體不受病毒侵襲。檢測恢復(fù)期患者體內(nèi)中和抗體的水平,可以評價患者體內(nèi)自身保護力的高低。預(yù)測中和抗體在患者體內(nèi)維持的時間,可以有助于指導(dǎo)疫苗的接種程序。對于布尼亞病毒科病毒來說,糖蛋白在細胞融合、感染和免疫中起著至關(guān)重要的作用,一般可以作為中和抗原表位,刺激機體產(chǎn)生中和抗體。包膜糖蛋白的某些位點可以與細胞受體結(jié)合,介導(dǎo)吸附和膜融合過程。同時糖蛋白作為一種抗原可以刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體,該抗體與糖蛋白抗原表位結(jié)合后,封閉了其與細胞受體結(jié)合的位點,糖蛋白就不能介導(dǎo)膜融合過程,從而不能感染細胞。因此,我們擬研究SFTSV糖蛋白Gn和Gc的功能特點,以定位SFTSV的中和抗原表位,這對于病毒致病機制的研究和疫苗的設(shè)計開發(fā)具有重要的意義。螨是一種體型微小的種類繁多的節(jié)肢動物,與人類和動物健康相關(guān)的螨包括恙螨、革螨、疥螨、塵螨、蠕形螨。其中,恙螨傳播恙蟲病,在我國具有尤其重要的醫(yī)學(xué)意義。恙螨幼主要寄生宿主是嚙齒類動物。恙蟲病由恙蟲病東方體引起,我國北方地區(qū)恙蟲病東方體的主要由小盾纖恙螨傳播,另外在小盾纖恙螨中也曾檢出SFTSV核酸。本研究擬對嚙齒類動物體表寄生的恙螨體內(nèi)是否攜帶SFTSV和其他病原體進行檢測,完善山東省恙螨攜帶病原體的情況。為了了解山東省嚙齒動物寄生螨中的病原體攜帶情況,并明確恙螨是否是SFTSV和漢坦病毒的傳播媒介,我們收集了捕獲的嚙齒動物耳部螨并進行了各種可疑病原體的PCR或RT-PCR檢測。研究目的1.搜集SFTS患者信息,分析其流行病學(xué)特征。2.檢測SFTS恢復(fù)期患者體內(nèi)中和抗體水平,并分析其隨時間變化情況,預(yù)測SFTS患者體內(nèi)中和抗體維持時間。3.構(gòu)建SFTSV糖蛋白Gn、Gc及其分段片段表達載體,并表達純化目的蛋白。4.定位SFTSV的中和抗原表位,用于疫苗的設(shè)計和開發(fā)。5.了解山東省青島市嚙齒動物的種類及分布情況。6.明確山東省青島市嚙齒動物寄生螨中的病原體攜帶情況。研究方法1.從山東省淄博市沂源縣疾病預(yù)防控制中心獲取2011年和2012年SFTS患者信息,分別于2011年11月、2012年11月、2013年7月及2015年6月四次對接受隨訪調(diào)查的恢復(fù)期患者進行上門隨訪,采集患者恢復(fù)期血清,并填寫調(diào)查問卷。運用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測SFTS患者恢復(fù)期血清中IgG水平,進一步確診SFTS。2.用vero細胞培養(yǎng)SFTSV,進行多次傳代,選取產(chǎn)生明顯空斑和細胞病變的病毒進行純化和后續(xù)實驗,建立重復(fù)性好的空斑形成單位法測定病毒滴度。運用空斑減少中和試驗(Plaque reduction neutralization test,PRNT)檢測患者血清中和抗體效價,以病毒在細胞中產(chǎn)生的空斑數(shù)減少50%的血清稀釋度(PRNT50)表示。3.運用Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)的初步處理,用SPSS 19.0選用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計方法進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計描述和分析,分析患者各項流行病學(xué)三間分布特征等,了解患者恢復(fù)期血清中和抗體效價的變化趨勢。4.運用 R 3.3.1 軟件通過廣義估計方程(Generalized Estimating Equations,GEE)預(yù)測中和抗體維持時間,binom程序包用于計算中和抗體效價及95%CI,geepack程序包用于計算GEE模型預(yù)測中和抗體維持時間,msm程序包用于Delta法計算中和抗體維持時間的95%CI。5.將糖蛋白Gn分成長度相等的4個片段,Gc按照結(jié)構(gòu)域的分界分成長度不同的6個片段,每兩個相鄰片段之間重合30個堿基,分別設(shè)計相應(yīng)的引物,在各段目的基因上添加6×His或Strep Ⅱ標簽,用PCR法擴增On、Gc全長及其分段片段目的基因,分別連入pCAGGS和pET32a(+)載體,構(gòu)建各段目的基因真核和原核表達載體,并進行目的蛋白的真核和原核表達。用Western blot法檢測各段目的蛋白的表達情況,用Ni-NTA柱純化表達出來的各段目的蛋白,進行后續(xù)試驗檢測。6.于2015年10月在山東省青島市黃島區(qū)野外丘陵地帶用捕鼠夾捕捉野鼠,將鼠耳剪下,用毛筆和鑷子在顯微鏡下螨分離,按照體型特征大致分類后分裝,同時解剖動物收集脾臟。7.提取螨和鼠脾的DNA和RNA,設(shè)計相關(guān)引物,運用]閌絇CR法或RT-PCR法擴增目的片段,回收目的條帶后連接轉(zhuǎn)化并測序,經(jīng)序列比對確定螨的屬種及螨攜帶病原體種類。8.應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理。用χ2檢驗方法對不同種屬的鼠的帶螨率進行統(tǒng)計推斷,P0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用Seqman和EditSeq軟件對序列進行編輯和處理,將陽性基因序列分別進行系統(tǒng)發(fā)育分析。在GenBank中找出相應(yīng)的立克次體序列,用ClustalX軟件進行多序列比對,然后用Mega 7軟件分別用Neighbor-joining(NJ)法和Maximum likelihood(ML)法進行系統(tǒng)發(fā)育分析,確定新立克次體與其他種類之間的進化關(guān)系。9.將立克次體陽性的螨的組織破碎液接種至vero細胞,培養(yǎng)7天后換液,提取脫落細胞的DNA,用]閌絇CR法檢測其中有無立克次體。研究結(jié)果1.SFTS患者血清中和抗體檢測及維持時間預(yù)測1.1在山東省淄博市沂源縣2011年和2012年共收集33例確診病例,死亡2例,6例患者拒絕采血和后續(xù)隨訪,因此共隨訪調(diào)查了發(fā)病的25位SFTS患者,其中2011年19例,2012年6例,分別進行信息和血清采集,四次隨訪共采集72份恢復(fù)期血清。25位患者在性別分布、年齡分布、職業(yè)分布、發(fā)病時間、臨床癥狀、被蜱叮咬情況等流行病學(xué)特征方面與以往報道大體一致。1.2經(jīng)雙抗原夾心ELISA法檢測,所有患者血清中均存在不同水平的IgG抗體,說明所有患者既往均感染過SFTSV。1.3經(jīng)過SFTSV的多次在Vero細胞中傳代培養(yǎng),得到了能使Vero細胞穩(wěn)定產(chǎn)生清晰空斑的病毒株,經(jīng)空斑形成單位法檢測病毒滴度為PFU=1.25×106 個/ml。1.4經(jīng)過預(yù)實驗和實驗方法的優(yōu)化,建立了空斑減少中和試驗法檢測中和抗體效價,所有患者血清中均存在不同水平的中和抗體,中和抗體效價PRNT50總體波動范圍為1:5～1:640。1.5綜合25位患者幾年來的中和抗體水平來看,中和抗體效價平均幾何滴度(Geometric mean titer,GMT)存在隨時間推移逐漸下降的趨勢,但是其中2位患者的第三份血清中和抗體效價高于第一次。1.6分別采用PRNT50=1:10和1:20兩個效價作為中和抗體保護力閾值,經(jīng)過廣義估計方程計算,從整體來說,當(dāng)PRNT50=1:20作為閾值時,中和抗體維持時間為6.7年(95%CI:5.1～8.3年);當(dāng)PRNT50=1:10作為閾值時,中和抗體維持時間為9.2年(95%CI:7～11.4年)。女性較男性中和抗體維持時間大約長2年;按照中和抗體初始效價的不同分組計算,初始效價越高,中和抗體維持時間越長;按照年齡分組,不同年齡組間抗體效價隨時間推移下降的趨勢差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2 SFTSV糖蛋白Gn、Gc及分段片段的表達及純化2.1 改造 pCAGGS 載體,成功構(gòu)建了 pCAGGS-Gn-strep、pCAGGS-Gc-strep、pCAGGS-Gn1-strep、pCAGGS-Gn2-strep、pCAGGS-Gn3-strep、pCAGGS-Gn4-strep、pCAGGS-Gc1-strep、pCAGGS-Gc2-strep、pCAGGS-Gc3-strep、pCAGGS-Gc4-strep、pCAGGS-Gc5-strep 和pCAGGS-Gc6-strep真核表達載體,轉(zhuǎn)染293T細胞后除Gn和Gc全長蛋白在上清液中成功分泌表達外,分段片段均未成功表達。2.2 改造 pET32a(+)載體,成功構(gòu)建了 pET32a-s-Gn、pET32a-s-Gc、pET32a-s-Gn1、pET32a-s-Gn2、pET32a-s-Gn3、pET32a-s-Gn4、pET32a-s-Gc 1、pETI32a-s-Gc2、pET32a-s-Gc3、pET32a-s-Gc4、pET32a-s-Gc5和pET32a-s-Gc6原核表達載體,并于16℃低溫誘導(dǎo)成功表達了各段可溶性目的蛋白,但是目的蛋白未能成功純化。3嚙齒動物寄生螨中病原體檢測3.1 2015年10月于山東省青島市黃島區(qū)室外共捕獲32只嚙齒動物,其中優(yōu)勢屬種為黑線姬鼠(53.13%,17/32)和小家鼠(28.13%,9/32)。15只鼠耳上有螨寄生,帶螨率為46.88%,不同種屬的鼠帶螨率沒有統(tǒng)計學(xué)差異。15只鼠耳恙螨指數(shù)多少不一,攜帶數(shù)量范圍為3～54只,共收集到319只小盾纖恙螨,恙螨指數(shù)為9.97。這些螨經(jīng)提取DNA后,應(yīng)用特異性引物進行線粒體DNA擴增,確定為小盾纖恙螨。3.2在螨的DNA中成功擴增出立克次體16S rRNA、gltA、ompB和17 kD相關(guān)序列,未成功擴增出ompA序列。螨中的該立克次體的最小感染率(MIR)為9/319,即2.8%。經(jīng)過BLAST序列比對發(fā)現(xiàn),用不同的基因引物擴增出的陽性立克次體序列分別對應(yīng)不同的立克次體,每種基因片段同源性為96.5%～99.4%。3.3在螨的DNA或RNA中未擴增出恙蟲病東方體、SFTSV和漢坦病毒相關(guān)序列。用PCR法在野鼠脾臟DNA中擴增ompB,16SrRNA,17kD,gltA和ompA 5個立克次體基因,結(jié)果均為陰性。3.4用擴增出的四段立克次體序列和四段序列拼接在一起的片段分別進行系統(tǒng)發(fā)育分析。ompB基因序列與Rickettsia sp.TwKM02的進化關(guān)系最為相近,位于進化樹的同一分支,支持率為92%。16SrRNA基因序列與R.australis的進化關(guān)系最為相近,位于進化樹的同一分支。17kD基因序列與R.akari的進化關(guān)系最為相近,位于進化樹的同一分支,支持率為62%。gltA基因序列與R.australis的進化關(guān)系最為相近,位于進化樹的同一分支。拼接片段序列與R.australis和R.akari進化關(guān)系最為接近,在同一分支。從進化關(guān)系來看,四個不同的基因分別與不同型別的立克次體位于同一進化分支,說明該立克次體為一種新型的立克次體,命名為Candidatus Rickettsia leptotrombidium。3.5細胞培養(yǎng)立克次,經(jīng)過四次細胞換液,未檢測出立克次體,說明沒有成功分離到該新型立克次體。研究結(jié)論1.選育出了能產(chǎn)生清晰空斑的SFTSV毒株,建立了完善的PRNT檢測SFTS患者血清中和抗體效價的方法。2.調(diào)查了沂源縣25位SFTS患者,每位患者分別采集了 3-4年間恢復(fù)期血清,首次隨訪并檢測了 SFTS患者長達4年血清中和抗體水平和變化趨勢,有助于評估人體抗SFTSV的免疫能力。3.首次采用統(tǒng)計學(xué)方法預(yù)測了 SFTS患者體內(nèi)中和抗體具有保護力的維持時間,為疫苗的免疫程序提供理論依據(jù)。中和抗體維持時間的長短在性別上有所差異,女性維持時間比男性長,提示免疫系統(tǒng)存在性別差異,在藥物治療和接種疫苗時應(yīng)考慮性別對效果的影響。4.成功構(gòu)建了 SFTSV糖蛋白Gn、Gc及其分段片段的真核和原核表達載體,表達了 SFTSV糖蛋白Gn、Gc及其分段片段的目的蛋白,各段目的蛋白的免疫原性是研制SFTSV亞單位疫苗的重要依據(jù)。5.成功在山東省青島市野鼠寄生螨中檢測出一種新型的立克次體,與R.australis和R.akari進化關(guān)系最為接近。鼠蜱中立克次體DNA陰性,說明鼠不能感染該立克次體或已過立克次體血癥期。6.本次采集的寄生螨中未檢測到恙蟲病東方體、SFTSV和漢坦病毒的核酸。未能成功分離該新型立克次體。
【圖文】：

逑／邋／邋／邋／’邋ｙ逡逑圖１－２山東省沂源縣２０１１－２０１２年ＳＦＴＳ患者的年齡分布逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｇｅｏｆ邋ＳＦＴＳ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｉｎ邋２０１１邋ａｎｄ邋２０１２邋ｉｎ邋Ｙｉｙｕａｎ逡逑Ｃｏｕｎｔｙ，邋Ｓｈａｎｄｏｎｇ邋Ｐｒｏｖｉｎｃｅ逡逑３．邋ＳＦＴＳ發(fā)病時間分布逡逑從ＳＦＴＳ的發(fā)病時間來看，患者都于４？１０月發(fā)病，病例多集中于６？８月份，占逡逑所有病例數(shù)的８４％邋（圖１－３）。這與ＳＦＴＳＶ的傳播媒介——蜱蟲的生活周期有逡逑很大的關(guān)系，當(dāng)人們外出務(wù)農(nóng)時，可能會遭到蜱蟲的叮咬，，感染ＳＦＴＳＶ。逡逑３６逡逑

１３邐２４逡逑圖１－１山東省沂源縣２０１１－２０１２年ＳＦＴＳ患者的性別和職業(yè)分布逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｇｅｎｄｅｒ邋ａｎｄ邋ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＦＴＳ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｉｎ邋２０１１邋ａｎｄ逡逑２０１２邋ｉｎ邋Ｙｉｙｕａｎ邋Ｃｏｕｎｔｙ，邋Ｓｈａｎｄｏｎｇ邋Ｐｒｏｖｉｎｃｅ逡逑１０邐９逡逑８逡逑６逡逑６逡逑４逡逑２逡逑２邋■逡逑０邋０邋０邋０逡逑０邋邐邋邐邐－—二—逡逑／邋／邋／邋／’邋ｙ逡逑圖１－２山東省沂源縣２０１１－２０１２年ＳＦＴＳ患者的年齡分布逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｇｅｏｆ邋ＳＦＴＳ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｉｎ邋２０１１邋ａｎｄ邋２０１２邋ｉｎ邋Ｙｉｙｕａｎ逡逑Ｃｏｕｎｔｙ，邋Ｓｈａｎｄｏｎｇ邋Ｐｒｏｖｉｎｃｅ逡逑３．邋ＳＦＴＳ發(fā)病時間分布逡逑從ＳＦＴＳ的發(fā)病時間來看，患者都于４？１０月發(fā)病，病例多集中于６？８月份，占逡逑所有病例數(shù)的８４％邋（圖１－３）。這與ＳＦＴＳＶ的傳播媒介——蜱蟲的生活周期有逡逑很大的關(guān)系，當(dāng)人們外出務(wù)農(nóng)時，可能會遭到蜱蟲的叮咬，感染ＳＦＴＳＶ。逡逑３６逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R512.8;R446.6

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 Fei Yuan;Aihua Zheng;;Entry of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus[J];Virologica Sinica;2017年01期

2 張振堂;方立竹;薛在峰;趙麗;馬東強;溫紅玲;劉建偉;張笑爽;于學(xué)杰;;2012年3月～2013年2月青島市黃島區(qū)腎綜合征出血熱流行特征[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2016年11期

3 王建躍;鄔輝;仝振東;嚴劍波;李科峰;唐安;;發(fā)熱伴血小板減少綜合征流行病學(xué)研究進展[J];中華流行病學(xué)雜志;2016年02期

4 李昱;周航;牟笛;殷文武;余宏杰;;中國2011-2014年發(fā)熱伴血小板減少綜合征流行特征分析[J];中華流行病學(xué)雜志;2015年06期

5 李阿茜;劉林;張碩;李川;張全福;梁米芳;李德新;;抗發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白單克隆抗體的制備和功能分析[J];病毒學(xué)報;2015年01期

6 徐雪華;李金萍;尹海英;劉國勝;蔣善祥;王偉慶;韓新強;劉靖宇;丁淑軍;牛國宇;;萊州市蜱種分類及感染新布尼亞病毒的病原學(xué)研究[J];預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇;2015年01期

7 ZHANG XiaoShuang;LIU Yan;ZHAO Li;LI Bing;YU Hao;WEN HongLing;YU Xue-Jie;;An emerging hemorrhagic fever in China caused by a novel bunyavirus SFTSV[J];Science China(Life Sciences);2013年08期

8 占建波;霍細香;官旭華;江永忠;徐軍強;李國明;劉力;詹發(fā)先;;湖北省發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒健康人群抗體水平分析[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2013年04期

9 王慶奎;葛恒明;李志鋒;單云峰;崔嵐;王燕萍;;從革螨和恙螨中檢測到發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒核酸[J];中國媒介生物學(xué)及控制雜志;2012年05期

10 劉洋;黃學(xué)勇;杜燕華;王海峰;許汴利;;河南發(fā)熱伴血小板減少綜合征流行區(qū)蜱類分布及媒介攜帶新布尼亞病毒狀況調(diào)查[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2012年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張萌;秋冬型恙蟲病疫區(qū)擴散的流行病學(xué)特征與機制研究[D];山東大學(xué);2014年

本文編號：2618668