【摘要】：傳染病是一類讓國際衛(wèi)生組織及各大醫(yī)院、疾病控制中心對之時刻保持高度警惕的一類疾病,通常由某種特異性的病原引起,可以在人與人,動物與動物,人與動物之間相互感染傳播。傳染病的暴發(fā)和流行對人類的生命財(cái)產(chǎn)構(gòu)成了巨大的威脅,歷史上幾次大的傳染病的暴發(fā)流行,可以說是觸目驚心,在很短時間內(nèi)就能在全球各個城市大范圍的流行,嚴(yán)重的甚至可以使一個城市癱瘓。尤其是呼吸道病毒引發(fā)的疾病。早期預(yù)防和快速而又精準(zhǔn)的診斷,對傳染病的防治來說至關(guān)重要。能夠引起傳染病的病原微生物種類很多,其中,致病最頻繁、危害最嚴(yán)重的莫過于病毒。尤其是近幾年SARS、H1N1、H5N1、H7N9、EBOLA、MERS病毒的出現(xiàn)和暴發(fā),讓我們認(rèn)識到與病毒的抗?fàn)幦沃囟肋h(yuǎn)。本研究首先建立了鼻咽拭子病毒核酸快速提取方法,再討論了聚合酶螺旋反應(yīng)擴(kuò)增RNA的可行性,然后針對6種呼吸道病毒(甲型H1N1流感病毒,甲型H5N1流感病毒,甲型H7N9流感病毒,甲型H3N2流感病毒,腺病毒,人偏肺病毒)建立快速檢測方法,最后組裝了可以在一個小時內(nèi)多重快速檢測這6種病毒的試劑盒。核酸提取已經(jīng)成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作,但是目前病毒核酸的提取方案非常多,而且繁簡不一�；鶎拥娜藛T密集的單位往往是傳染病暴發(fā)的起點(diǎn),非常需要在原地能迅速的對核酸進(jìn)行診斷,這對傳染病的防控有重大的意義。然而事實(shí)是,根據(jù)現(xiàn)場或者基層的檢測和治療條件,要求檢測試劑盒的特點(diǎn)是快速、操作方便、使用簡單、無儀器化、專業(yè)化需求低。我們根據(jù)實(shí)際情況研究并制作了鼻咽拭子病毒核酸快速提取液,操作過程操作簡單,無需任何儀器,既能常溫保存,又能有效防止交叉污染,專業(yè)化程度需求低,無需提前配液,5分鐘內(nèi)可以提取完成,可以直接用于后續(xù)的核酸擴(kuò)增反應(yīng),包括常規(guī)PCR、熒光定量PCR、PSR、LAMP等溫?cái)U(kuò)增等。聚合酶螺旋反應(yīng)已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測多種細(xì)菌和DNA病毒,如肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌和腸道病毒71型等,均可在較短時間內(nèi)檢測出相應(yīng)病原微生物,并且特異性很高,為此類疾病提供了一種新的便捷可靠的檢測方法和診斷依據(jù)。本研究首先探討聚合酶螺旋反應(yīng)擴(kuò)增RNA的理論可行性,由于PCR法需要熱循環(huán),其中一個溫度為90℃-95℃,在這個溫度下逆轉(zhuǎn)錄酶是沒有活性的,這也就決定了熒光定量PCR法在檢測RNA病毒時需要分成兩個步驟,先在較低溫度下逆轉(zhuǎn)錄RNA,然后再熱循環(huán)擴(kuò)增cDNA,這樣就必然使檢測的時間變長。我們在研究逆轉(zhuǎn)錄酶時,發(fā)現(xiàn)其在30℃-68℃的情況下仍然存在活性,這個溫度范圍包含了聚合酶螺旋擴(kuò)增的溫度,這樣的話就可以讓二者同時進(jìn)行,避免了分兩次反應(yīng)的麻煩,大大節(jié)省了時間。該推論在本研究中也得到了證實(shí),在這種方法下建立的聚合酶螺旋反應(yīng)操作更加簡單、方便,同時拓展了聚合酶螺旋反應(yīng)的應(yīng)用范圍。流行性感冒是最為常見的一種呼吸道疾病,由流感病毒引起,傳播速度快,易暴發(fā)流行。每年全世界的各個國家都會出現(xiàn)流感的季節(jié)性流行以及地域性的暴發(fā),據(jù)世界衛(wèi)生組織資料統(tǒng)計(jì),每年感染的人之中,有300萬至500萬會發(fā)展成為重癥感染,約30至50萬人死亡,屬于較為常見且較難防控的傳染病之一。流行性感冒在治療和防控中的最大難題是,流感病毒容易發(fā)生抗原性變異,從而使得該病毒能夠逃脫宿主的免疫識別,引發(fā)了新類型流感的暴發(fā)和流行。針對甲型H1N1流感病毒,甲型H5N1流感病毒,甲型H7N9流感病毒,甲型H3N2流感病毒,腺病毒,人偏肺病毒6種病毒的特異性基因,設(shè)計(jì)了PSR引物,通過實(shí)時濁度法和顯色法兩種方法判斷結(jié)果。確定各自最佳溫度;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明引物具有良好的特異性與其他呼吸道病原核酸無交叉反應(yīng),敏感性達(dá)到10-100拷貝,比普通PCR敏感性高出10-100倍。該方法具有簡單快速,特異性強(qiáng),敏感性高等特點(diǎn),特別適合現(xiàn)場和基層單位應(yīng)用推廣。本研究成功建立了“室溫貯運(yùn)、開封即檢、操作便捷、結(jié)果直觀”的6種呼吸道病毒快速檢測試劑盒,該試劑盒由“采樣棉簽、樣品處理管、檢測管、恒溫儀”4部分組成。經(jīng)過“棉簽采樣、震蕩裂解、滴加樣本、恒溫?cái)U(kuò)增、觀察結(jié)果”5個簡單操作步驟,1個小時內(nèi)全部完成。不需要其它儀器設(shè)備配合,不需要配制任何液體,甚至在斷水?dāng)嚯姷臉O端環(huán)境下也能開展核酸檢測。適合基層衛(wèi)生單位推廣應(yīng)用。
【圖文】：

應(yīng)過程中最關(guān)鍵的一種酶，即 Bst DNA 聚合酶，是一種具性以及 DNA 聚合酶活性的酶，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明其最適反應(yīng)溫 CPA 法都是基于此酶的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法。 作為一種新，基于 Bst DNA 聚合酶的聚合酶螺旋反應(yīng)采用了混合引物復(fù)合引物 Ft 和 Bt，也是聚合酶螺旋反應(yīng)的主引物，如圖 0-本引物 FB 和 BP 作用下就可以發(fā)生 PSR 反應(yīng)，但這個過一般在 50min 左右。如果再引入兩條加速引物 IF 和 IB，大大縮短，一般可在 30min 內(nèi)完成。IF 和 IB 能起到加速 PSR 必須引物。PSR 的發(fā)生只要含有最基本引物就可以，，加速引物的條數(shù)≥0 條，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同可以任意搭配。只使用一條加速引物時，，提高了反應(yīng)速率，但是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如，出峰時間甚至能提前至 20min 以內(nèi) 。

軍事科學(xué)院博（碩）士學(xué)位論文 1-1 所示，本產(chǎn)品包括 a 和 b 兩端加樣端，槍口上游帶有濾膜，可間為上樣處，可以用力打開，加樣多次優(yōu)化得到的。既保證了對樣樣本時，可以吸附樣本中雜質(zhì)，同
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

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5 吳碧

本文編號：2603958