【摘要】：傳染病是一類讓國際衛(wèi)生組織及各大醫(yī)院、疾病控制中心對之時刻保持高度警惕的一類疾病,通常由某種特異性的病原引起,可以在人與人,動物與動物,人與動物之間相互感染傳播。傳染病的暴發(fā)和流行對人類的生命財產(chǎn)構成了巨大的威脅,歷史上幾次大的傳染病的暴發(fā)流行,可以說是觸目驚心,在很短時間內就能在全球各個城市大范圍的流行,嚴重的甚至可以使一個城市癱瘓。尤其是呼吸道病毒引發(fā)的疾病。早期預防和快速而又精準的診斷,對傳染病的防治來說至關重要。能夠引起傳染病的病原微生物種類很多,其中,致病最頻繁、危害最嚴重的莫過于病毒。尤其是近幾年SARS、H1N1、H5N1、H7N9、EBOLA、MERS病毒的出現(xiàn)和暴發(fā),讓我們認識到與病毒的抗爭任重而道遠。本研究首先建立了鼻咽拭子病毒核酸快速提取方法,再討論了聚合酶螺旋反應擴增RNA的可行性,然后針對6種呼吸道病毒(甲型H1N1流感病毒,甲型H5N1流感病毒,甲型H7N9流感病毒,甲型H3N2流感病毒,腺病毒,人偏肺病毒)建立快速檢測方法,最后組裝了可以在一個小時內多重快速檢測這6種病毒的試劑盒。核酸提取已經(jīng)成為分子生物學實驗技術中最重要、最基本的操作,但是目前病毒核酸的提取方案非常多,而且繁簡不一。基層的人員密集的單位往往是傳染病暴發(fā)的起點,非常需要在原地能迅速的對核酸進行診斷,這對傳染病的防控有重大的意義。然而事實是,根據(jù)現(xiàn)場或者基層的檢測和治療條件,要求檢測試劑盒的特點是快速、操作方便、使用簡單、無儀器化、專業(yè)化需求低。我們根據(jù)實際情況研究并制作了鼻咽拭子病毒核酸快速提取液,操作過程操作簡單,無需任何儀器,既能常溫保存,又能有效防止交叉污染,專業(yè)化程度需求低,無需提前配液,5分鐘內可以提取完成,可以直接用于后續(xù)的核酸擴增反應,包括常規(guī)PCR、熒光定量PCR、PSR、LAMP等溫擴增等。聚合酶螺旋反應已經(jīng)成功應用于檢測多種細菌和DNA病毒,如肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌和腸道病毒71型等,均可在較短時間內檢測出相應病原微生物,并且特異性很高,為此類疾病提供了一種新的便捷可靠的檢測方法和診斷依據(jù)。本研究首先探討聚合酶螺旋反應擴增RNA的理論可行性,由于PCR法需要熱循環(huán),其中一個溫度為90℃-95℃,在這個溫度下逆轉錄酶是沒有活性的,這也就決定了熒光定量PCR法在檢測RNA病毒時需要分成兩個步驟,先在較低溫度下逆轉錄RNA,然后再熱循環(huán)擴增cDNA,這樣就必然使檢測的時間變長。我們在研究逆轉錄酶時,發(fā)現(xiàn)其在30℃-68℃的情況下仍然存在活性,這個溫度范圍包含了聚合酶螺旋擴增的溫度,這樣的話就可以讓二者同時進行,避免了分兩次反應的麻煩,大大節(jié)省了時間。該推論在本研究中也得到了證實,在這種方法下建立的聚合酶螺旋反應操作更加簡單、方便,同時拓展了聚合酶螺旋反應的應用范圍。流行性感冒是最為常見的一種呼吸道疾病,由流感病毒引起,傳播速度快,易暴發(fā)流行。每年全世界的各個國家都會出現(xiàn)流感的季節(jié)性流行以及地域性的暴發(fā),據(jù)世界衛(wèi)生組織資料統(tǒng)計,每年感染的人之中,有300萬至500萬會發(fā)展成為重癥感染,約30至50萬人死亡,屬于較為常見且較難防控的傳染病之一。流行性感冒在治療和防控中的最大難題是,流感病毒容易發(fā)生抗原性變異,從而使得該病毒能夠逃脫宿主的免疫識別,引發(fā)了新類型流感的暴發(fā)和流行。針對甲型H1N1流感病毒,甲型H5N1流感病毒,甲型H7N9流感病毒,甲型H3N2流感病毒,腺病毒,人偏肺病毒6種病毒的特異性基因,設計了PSR引物,通過實時濁度法和顯色法兩種方法判斷結果。確定各自最佳溫度;進一步實驗表明引物具有良好的特異性與其他呼吸道病原核酸無交叉反應,敏感性達到10-100拷貝,比普通PCR敏感性高出10-100倍。該方法具有簡單快速,特異性強,敏感性高等特點,特別適合現(xiàn)場和基層單位應用推廣。本研究成功建立了“室溫貯運、開封即檢、操作便捷、結果直觀”的6種呼吸道病毒快速檢測試劑盒,該試劑盒由“采樣棉簽、樣品處理管、檢測管、恒溫儀”4部分組成。經(jīng)過“棉簽采樣、震蕩裂解、滴加樣本、恒溫擴增、觀察結果”5個簡單操作步驟,1個小時內全部完成。不需要其它儀器設備配合,不需要配制任何液體,甚至在斷水斷電的極端環(huán)境下也能開展核酸檢測。適合基層衛(wèi)生單位推廣應用。
【圖文】：

應過程中最關鍵的一種酶，即 Bst DNA 聚合酶，是一種具性以及 DNA 聚合酶活性的酶，實驗數(shù)據(jù)表明其最適反應溫 CPA 法都是基于此酶的核酸等溫擴增方法。 作為一種新，基于 Bst DNA 聚合酶的聚合酶螺旋反應采用了混合引物復合引物 Ft 和 Bt，也是聚合酶螺旋反應的主引物，如圖 0-本引物 FB 和 BP 作用下就可以發(fā)生 PSR 反應，但這個過一般在 50min 左右。如果再引入兩條加速引物 IF 和 IB，大大縮短，一般可在 30min 內完成。IF 和 IB 能起到加速 PSR 必須引物。PSR 的發(fā)生只要含有最基本引物就可以，，加速引物的條數(shù)≥0 條，根據(jù)實驗的不同可以任意搭配。只使用一條加速引物時，，提高了反應速率，但是遠遠不如，出峰時間甚至能提前至 20min 以內 。

軍事科學院博（碩）士學位論文 1-1 所示，本產(chǎn)品包括 a 和 b 兩端加樣端，槍口上游帶有濾膜，可間為上樣處，可以用力打開，加樣多次優(yōu)化得到的。既保證了對樣樣本時，可以吸附樣本中雜質，同
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

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8 容中生;;呼吸道病毒感染性疾病[J];國外醫(yī)學(內科學分冊);1984年09期

9 李佩佩;聶俊瑋;劉沃滿;唐玉芬;楊景謀;黃冬梅;;茂名市2015-2016年兒童呼吸道病毒流行特征分析[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2018年05期

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6 董競成;劉羽華;宮兆華;董曉輝;謝瑾玉;巫善美;;扶正祛邪顆粒對呼吸道病毒易感人群免疫細胞及因子的影響[A];第七次全國中西醫(yī)結合呼吸病學術交流大會論文匯編（一）[C];2004年

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9 楊進;中醫(yī)治療呼吸道病毒性感染的思考[N];中國醫(yī)藥報;2006年

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本文編號：2603958