【摘要】：背景與目的干細(xì)胞移植在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)等多系統(tǒng)疾病治療的研究領(lǐng)域中取得了顯著地進展,但干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞關(guān)系密切,都具有自我更新和多向分化能力,不僅有相似的代謝活性,而且有很多相同的沉默基因。近年來關(guān)于干細(xì)胞成瘤的報道使干細(xì)胞移植安全性被質(zhì)疑,而且移植部位常發(fā)生在脊髓、腦、眼等較敏感的部位,即使形成很小的腫瘤都會導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙,移植后干細(xì)胞的示蹤可盡早檢測到腫瘤的發(fā)生。在干細(xì)胞活體影像學(xué)示蹤領(lǐng)域,主要利用光學(xué)、核醫(yī)學(xué)以及磁共振成像(MRI),其中,MRI因具有三維多序列成像且高分辨率無輻射等優(yōu)點而最具潛力。MRI示蹤干細(xì)胞常用方法包括直接和間接兩種方法,直接示蹤法應(yīng)用磁性納米微粒先標(biāo)記干細(xì)胞并利用MRI對磁標(biāo)記細(xì)胞進行檢測,但是由于細(xì)胞的分裂及再攝取等問題限制其對干細(xì)胞的長期縱向示蹤;間接示蹤法常采用MRI報告基因標(biāo)記干細(xì)胞,并利用其在細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)表達來示蹤干細(xì)胞,有效克服了直接示蹤法不能對細(xì)胞進行長期示蹤的缺陷。雖然MRI報告基因成像可實現(xiàn)對干細(xì)胞移植后的長期縱向示蹤,但無法區(qū)分早期瘤變細(xì)胞和瘤變前的干細(xì)胞。解決這一問題的關(guān)鍵在于找到一種在干細(xì)胞瘤變前后差異化表達的基因,該基因在瘤變細(xì)胞內(nèi)高表達,而在干細(xì)胞及其正常分化的組織細(xì)胞不表達或低表達,利用該基因的啟動子驅(qū)動報告基因在瘤變細(xì)胞內(nèi)特異性表達,理論上可以實現(xiàn)報告基因成像對干細(xì)胞瘤變的早期檢出。PEG3(progression elevated gene-3)是一種來源于嚙齒動物的腫瘤特異性基因,在腫瘤細(xì)胞中,PEG3啟動子活性受到PEA3、AP-1兩種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)而高表達。該基因在人癌細(xì)胞系同樣高表達,而在正常組織細(xì)胞極少表達;目前PEG3啟動子已被用于腫瘤的靶向治療和腫瘤的發(fā)生機制等研究領(lǐng)域。有關(guān)利用PEG3啟動子驅(qū)動報告基因?qū)Ω杉?xì)胞瘤變進行活體成像的研究尚未見文獻報道。本實驗將腫瘤特異性啟動子PEG3與MRI報告基因FTH1相結(jié)合,構(gòu)建PEG3-FTH1-LV慢病毒載體,將PEG3-FTH1系統(tǒng)轉(zhuǎn)入大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)內(nèi),并誘導(dǎo)MSCs瘤變,在誘導(dǎo)前后觀察FTH1基因表達、聚鐵效應(yīng)以及MRI信號改變,探究利用PEG3啟動子驅(qū)動MRI報告基因FTH1在干細(xì)胞瘤變時特異性表達及聚鐵,并被MRI檢測的可行性。方法1 PEG3-FTH1-LV慢病毒載體的構(gòu)建及病毒包裝PEG3啟動子、FTH1基因(委托漢恒生物有限公司合成)與載體p HBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZSgreen-puro通過酶切、擴增、連接得到pHBLV-PEG3-FTH1-3flag-EF1-ZSgreen-puro,測序鑒定構(gòu)建成功后與質(zhì)粒(p SPAX2、p MD2G)同時感染293T細(xì)胞,收集病毒液離心得到病毒并標(biāo)記為PEG3-FTH1-LV。同時構(gòu)建CMV-FTH1-LV作為陽性對照,并將未感染病毒的MSCs細(xì)胞作為陰性對照。2慢病毒感染MSCs并誘導(dǎo)瘤變待MSCs細(xì)胞融合度達30%-40%,分別添加含PEG3-FTH1-LV、C MV-FTH1-LV病毒培養(yǎng)基,感染48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達,嘌呤霉素篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達株MSCs-PEG3-FTH1、MSCs-CM V-FTH1。將MSCs、MSCs-PEG3-FTH1、MSCs-CMV-FTH1分別與大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6間接共培養(yǎng)2周誘導(dǎo)其瘤變?yōu)門MSCs、TMSCs-PEG3-FTH1、TMSCs-CMV-FTH1。3誘導(dǎo)前后細(xì)胞的鑒定觀察共培養(yǎng)前后細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞流式檢測共培養(yǎng)前后細(xì)胞表面抗體CD29、CD34、CD45、CD90表達情況,結(jié)晶紫染色檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞遷移能力,CCK-8檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞增殖速度,裸鼠皮下成瘤實驗驗證細(xì)胞瘤變。4誘導(dǎo)前后細(xì)胞FTH1表達及聚鐵Western blots檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞FTH1表達,誘導(dǎo)前后細(xì)胞分別經(jīng)FAC培養(yǎng)基作用72h后,3.0T MRI觀察細(xì)胞T2WI信號,普魯士藍(lán)染色、細(xì)胞透射電鏡觀察細(xì)胞誘導(dǎo)前后FTH1基因表達所引起的聚鐵效應(yīng)。5誘導(dǎo)后細(xì)胞移植物聚鐵效應(yīng)檢測選取4-6W、20g左右健康雄性裸鼠,將誘導(dǎo)后細(xì)胞種植于裸鼠頸背部皮下,每天500mmol/L FAC溶液喂養(yǎng),于細(xì)胞種植后第1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d行3.0T MR觀察移植物T2WI信號;細(xì)胞移植后形成的移植物取出后行普魯士藍(lán)染色及透射電鏡觀察腫塊內(nèi)鐵顆粒情況,行蘇木素-尹紅染色觀察其病理結(jié)構(gòu)。結(jié)果1 PEG3-FTH1-LV慢病毒載體的鑒定及病毒包裝經(jīng)DNA測序、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳等技術(shù)測定已成功構(gòu)建PEG3-FTH1-LV慢病毒載體,病毒滴度為1×108TU/ml。2穩(wěn)定株的建立慢病毒感染細(xì)胞48h后綠色熒光明顯表達,嘌呤霉素篩選7天再半量篩選3天后成功構(gòu)建MSCs-PEG3-FTH1、MSCs-CMV-FTH1穩(wěn)定株。3誘導(dǎo)前后細(xì)胞的鑒定顯微鏡下觀察到MSCs細(xì)胞排列整齊,呈魚群樣生長,TMSCs細(xì)胞較MSCs細(xì)胞變小,核漿比變大,并排列紊亂;經(jīng)CCK-8檢測顯示TMSCs細(xì)胞較MSCs細(xì)胞增殖速度加快;結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示TMSs細(xì)胞較MSCs細(xì)胞遷移能力增強;流式細(xì)胞檢測結(jié)果分析得到TMSCs細(xì)胞較MSCs細(xì)胞CD34、CD45表達增加,CD90表達減少;裸鼠皮下成瘤實驗顯示TMSCs細(xì)胞裸鼠皮下成瘤陽性,而MSCs不形成腫瘤。4誘導(dǎo)前后細(xì)胞FTH1表達及聚鐵效應(yīng)Western blots結(jié)果顯示MSCs、MSCs-PEG3-FTH1、TMSCs細(xì)胞不表達或少量表達FTH1蛋白,而MSCs-CMV-FTH1、TMSCs-PEG3-FTH1、TMSCs-CMV-FTH1細(xì)胞均大量表達FTH1蛋白,MRI顯示T MSCs-PEG3-FTH1細(xì)胞T2WI信號較MSCs-PEG3-FTH1細(xì)胞明顯降低。普魯士藍(lán)染色和細(xì)胞透射電鏡觀察到MSCs-CMV-FTH1、TMSCsPEG3-FTH1、TMSCs-CMV-FTH1細(xì)胞內(nèi)存在鐵顆粒,而在MSCs、M SCs-PEG3-FTH1、TMSCs細(xì)胞內(nèi)無明顯鐵顆粒。5誘導(dǎo)后細(xì)胞移植物體內(nèi)聚鐵效應(yīng)MRI顯示TMSCs-PEG3-FTH1細(xì)胞移植物信號與TMSCs-CMV-FT H1細(xì)胞移植物信號相似且均較TMSCs細(xì)胞移植物信號降低,普魯士藍(lán)染色和細(xì)胞透射電鏡均觀察到TMSCs-PEG3-FTH1與TMSCs-CMVFTH1細(xì)胞移植物內(nèi)有明顯的鐵顆粒而TMSCs細(xì)胞移植物內(nèi)鐵顆粒不明顯。結(jié)論本實驗成功構(gòu)建PEG3啟動子控制FTH1基因表達的慢病毒載體并感染MSCs細(xì)胞,證實了PEG3啟動子可驅(qū)動報告基因FTH1在干細(xì)胞瘤變時特異性表達并能被MRI檢測。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文正置顯微鏡 OLYMPUS純水儀 Millipore0.22um 混合纖維素濾膜 Millipore細(xì)胞計數(shù)板 上海醫(yī)用儀器廠細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板 Costar1.3 慢病毒載體、菌株和細(xì)胞株1.3.1 病毒包裝系統(tǒng)慢病毒載體和包裝質(zhì)粒 pMD2G、pSPAX2 （圖 1）。

ACCAACGAGGTGGCCGAATCTTCCTTCAGGATATCAAGAAACCAGACTGTGATGACTGGGAGAGCGGGCTGAATGCAATGGAGTGTGCATTACATTTGGAAAAAAATGTGAATCAGTCACTACTGGAACTGCACAAACTGGCCACTGACAAAAATGACCCCCATTTGTGTGACTTCATTGAGACACATTACCTGAATGAGCAGGTGAAAGCCATCAAAGAATTGGGTGACCACGTGACCAACTTGCGCAAGATGGGAGCGCCCGAATCTGGCTTGGCGGAATATCTCTTTGACAAGCACACCCTGGGAGACAGTGATAATGAAAGCGGATCCTCGGTACCAAGCTTAAGTGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATAAAGATCCATCGATACTAGTAAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAG與正確序列對比結(jié)果顯示無誤（圖 2）；
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R445.2;R457.7

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 修雁,陳紹亮;報告基因核醫(yī)學(xué)顯像及研究進展[J];中華核醫(yī)學(xué)雜志;2003年06期

2 曾yN青,吳鶴齡;報告基因——哺乳類動物遺傳學(xué)研究的新工具[J];生物工程進展;1992年03期

3 王弘,鄭文嶺,楊連生,于淑娟,賴晃文,楊傳紅,馬文麗;以綠色熒光蛋白為報告基因的釀酒酵母表達載體的構(gòu)建[J];廣東醫(yī)學(xué);2002年12期

4 尤崇革,周旭,侯玲,李益民;綠色熒光報告基因在細(xì)胞免疫檢測中的應(yīng)用[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進展;2002年01期

5 胡春霞;葉夢情;岑益超;易明花;;以綠色熒光蛋白為報告基因的環(huán)境砷離子生物檢測體系的構(gòu)建[J];環(huán)境與健康雜志;2013年07期

6 王玲;董關(guān)木;;綠色熒光蛋白報告基因在病毒檢測中的應(yīng)用及研究[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進展;2008年04期

7 于紅,趙磊,張文卿,張學(xué)成;建立以EGFP為報告基因檢測HSV感染的細(xì)胞株[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2004年10期

8 李強;植物基因工程中常用的報告基因[J];生物學(xué)雜志;1995年01期

9 徐丹丹;陳宏偉;方向明;;鐵蛋白報告基因在腫瘤分子影像中的研究進展[J];臨床放射學(xué)雜志;2019年02期

10 王勁 ,張雪林;酪氨酸酶基因作報告基因的磁共振分子影像學(xué)研究進展[J];國外醫(yī)學(xué)(臨床放射學(xué)分冊);2004年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 侯穎;張大銘;;報告基因在哺乳動物細(xì)胞中表達的研究[A];中國動物學(xué)會獸類學(xué)分會第六屆會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2004年

2 莫志成;李曉燕;李宏帆;程小款;吳寧華;沈s輙2;;競爭RT-PCR定量檢測氯霉素乙�；D(zhuǎn)移酶mRNA水平方法的建立及初步應(yīng)用[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第八屆會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

3 裴之俊;蘭曉莉;覃春霞;王朋;何勇;田月麗;張永學(xué);;多功能報告探針的制備及應(yīng)用多模態(tài)分子顯像監(jiān)測干細(xì)胞的可行性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第九次全國核醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2011年

4 張一帆;李彪;江旭峰;馮國偉;朱承謨;;NIS基因作為報告基因的可行性研究[A];第三屆全國核素顯像暨核素治療學(xué)術(shù)交流會論文匯編[C];2006年

5 張一帆;王俊;周翔;李彪;朱承謨;;NIS基因作為報告基因的可行性研究[A];第四屆全國中青年核醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

6 申寶忠;王凱;王可錚;王知非;黃濤;李偉華;王丹;;轉(zhuǎn)鐵蛋白受體報告基因MR分子成像監(jiān)測內(nèi)皮抑素基因表達及治療效果[A];中華醫(yī)學(xué)會第16次全國放射學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2009年

7 覃春霞;蘭曉莉;夏曉天;張永學(xué);;新型報告基因/報告探針系統(tǒng)hERL/~(18)F-FES的評估[A];中華醫(yī)學(xué)會第九次全國核醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2011年

8 張爾婷;江娜;劉清;李華平;朱慧蘭;;以分泌型熒光素酶為報告基因的Nrf2報告系統(tǒng)的建立與驗證[A];2016全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2016年

9 伍仕敏;周新;楊華芬;劉永學(xué);;基于報告基因的PPRE轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)模型的建立及應(yīng)用[A];全國第2屆中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會議暨國家中醫(yī)藥管理局第1屆傳染病協(xié)作組會議論文匯編[C];2008年

10 王丹;陸葵青;包騏林;胡景清;宋杰;周明明;周林樺;李云;;環(huán)境內(nèi)分泌干擾物篩查方法的建立[A];第十三屆中國西部營養(yǎng)與健康高峰論壇論文集[C];2018年

相關(guān)重要報紙文章 前1條

1 記者 李天舒　通訊員 朱丹萍;可攜帶報告基因的甲型流感病毒“人造”成功[N];健康報;2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 柳梅;酪氨酸酶報告基因用于干細(xì)胞移植后心梗模型多模態(tài)顯像[D];華中科技大學(xué);2018年

2 呂靖;報告基因及GLP-1受體顯像對移植細(xì)胞長期監(jiān)測的可行性研究[D];上海交通大學(xué);2017年

3 邵陽光;可逆性組蛋白乙�；揎椩谌薟T1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用及其分子機制研究[D];東北師范大學(xué);2005年

4 徐莉春;環(huán)境內(nèi)分泌干擾物篩選的受體報告基因試驗研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2005年

5 茆燦泉;報告基因（lux，，GFP）載體的構(gòu)建和在腫瘤細(xì)胞及組織中表達的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1999年

6 韓卿;JNK3與p65相互作用的分子機制及其功能研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

7 代曉朋;microRNA-15b在乙型肝炎病毒復(fù)制中的作用及分子機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

8 張穎;漢坦病毒非編碼區(qū)調(diào)控功能的研究應(yīng)用及粘膜免疫初探[D];山東大學(xué);2009年

9 張龍;Dpr1和Dpr2在調(diào)節(jié)Wnt/TGF-β信號中的作用[D];清華大學(xué);2008年

10 陳云飛;USP21負(fù)調(diào)控STING介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素信號通路的激活功能及其機制的研究[D];華東師范大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 孫君;腫瘤特異性啟動子PEG3驅(qū)動報告基因FTH1在干細(xì)胞瘤變時表達及MR成像[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2019年

2 莫麗芬;雞Dazl熒光報告基因追蹤生殖細(xì)胞遷移和分化的研究[D];廣西大學(xué);2019年

3 賈春翠;報告基因法檢測重組人sgp130-Fc融合蛋白生物學(xué)活性[D];中國食品藥品檢定研究院;2019年

4 李一沛;樹突狀細(xì)胞核蛋白-1的功能研究[D];蘇州大學(xué);2016年

5 楊玉帥;報告基因法測定重組人促紅素生物學(xué)活性研究[D];中國食品藥品檢定研究院;2014年

6 徐小林;雌激素受體介導(dǎo)的報告基因試驗方法的建立[D];南京醫(yī)科大學(xué);2008年

7 賈瑞瑞;Dip2a-LacZ報告基因小鼠模型的制作及表達分析[D];東北師范大學(xué);2015年

8 李晨;表達雙報告基因的慢病毒顆粒的制備及體外標(biāo)記小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

9 趙海濤;基于報告基因的環(huán)境（抗）雌激素和環(huán)境（抗）雄激素體外細(xì)胞檢測系統(tǒng)的建立[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 Aweya Jude Juventus;蛋白激酶D1（PKD1）在HIV-1復(fù)制中的作用[D];廈門大學(xué);2009年

本文編號：2602588