【摘要】：特異性靶向臨床生物標(biāo)志物的重組單克隆抗體越來越多地被用作診斷許多疾病的有力工具。綠色熒光蛋白(GFP)作為熒光體及其紅移突變體,增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP),其熒光強(qiáng)度比野生型GFP強(qiáng)35倍,已被用作熒光標(biāo)記物,用于觀察體內(nèi)和體外蛋白質(zhì)的定位。GFP/EGFP與抗體的遺傳融合導(dǎo)致熒光抗體的擴(kuò)增,熒光抗體已被用作體外研究和腫瘤成像的可靠檢測(cè)工具。胰島素原被用作靶抗原并且廣泛用于治療糖尿病。最近,幾種針對(duì)胰島素原的scFv被用于構(gòu)建免疫測(cè)定,其特異性地靶向血清和血液中的胰島素物質(zhì)。本論文制備了重組胰島素原和scFv-EGFP融合蛋白,并測(cè)試了它們的活性。主要研究成果如下:(1)將大腸桿菌BL21 pET-Ins菌株在30℃,220rpm下培養(yǎng)至OD_(600)≥0.6,然后用1mmol/L IPTG在26℃,220rpm下誘導(dǎo)4小時(shí)。通過SDS-PAGE分析顯示,破碎后離心上清液中沒有重組人胰島素原的顯著積累。在破碎后的離心沉淀中,重組人胰島素原蛋白占總沉淀蛋白的49.9%。這表明人胰島素原主要以包涵體的形式存在。(2)提取人胰島素原包涵體,分別用尿素和包涵體洗滌液溶解。SDS-PAGE分析顯示,包涵體中人胰島素原的純度為84.4%。來自洗滌和重新溶解的包涵體的人胰島素原的純度為99.8%。融合蛋白的產(chǎn)量約為197.12mg/L。(3)提取1~6株轉(zhuǎn)基因巴斯德畢赤酵母GS115 scFv-EGFP的核DNA,用一對(duì)引物SEP1和SEP2擴(kuò)增,scFv-EGFP編碼片段的1208~1724bp(總長(zhǎng)516bp)。結(jié)果顯示,巴斯德畢赤酵母GS115 scFv-EGFP 1-6菌株呈現(xiàn)出清晰的特異性條帶,大小為500bp。(4)通過熒光顯微鏡分析轉(zhuǎn)基因巴斯德畢赤酵母scFv-EGFP-6和巴斯德畢赤酵母GS115菌株的細(xì)胞。重組蛋白的熒光在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中可見。(5)將巴斯德畢赤酵母GS115 scFv-EGFP 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11和12號(hào)菌株在30℃和220rpm下培養(yǎng)96小時(shí)。通過SDS-PAGE電泳分析來自沉淀的發(fā)酵液和來自破碎的細(xì)胞沉淀的蛋白質(zhì)。電泳結(jié)果顯示菌株1~12的特異性條帶接近54.6 kDa(scFv-EGFP的理論分子量)。帶蛋白分別占30.3%,11.1%,19.1%,60.6%,63.2%,68.1%,35.4%在通過超聲破碎(按1至12號(hào)菌株的順序)破碎后,細(xì)胞沉淀中總蛋白質(zhì)的含量為3.8%,4.1%,10.8%,7.1%和15.9%。來自發(fā)酵液的蛋白質(zhì)首先通過丙酮沉淀,然后通過SDS-PAGE分析。蛋白質(zhì)條帶接近54.6kDa,占發(fā)酵液中總蛋白質(zhì)的30.0%,14.8%,23.3%,31.7%,30.4%,27.3%,35.3%,18.4%,14.1%,0.0%,5.9%和0.0%(按1至12號(hào)菌株的順序)。(6)通過蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)含有scFv-EGFP融合蛋白的樣品,發(fā)現(xiàn)scFv-EGFP樣品可以與抗GFP的抗體結(jié)合。(7)用30%,40%和50%硫酸銨沉淀巴斯德畢赤酵母GS115 scFv-EGFP-6細(xì)胞的上清液。離心后,在Ni-NTA親和柱上進(jìn)一步純化分級(jí)沉淀后制備的溶液。結(jié)果顯示,接近54.6kDa的蛋白質(zhì)條帶未出現(xiàn)在洗脫緩沖液中。這些結(jié)果表明重組融合蛋白scFv-EGFP可能不與Ni-NTA結(jié)合。(8)根據(jù)(7)結(jié)果,我們重新檢查了pGAPαA-scFv-EGFP載體序列,發(fā)現(xiàn)scFv-EGFP編碼片段末端出現(xiàn)了移碼突變,在Myc和His的標(biāo)簽前面出現(xiàn)終止密碼子TAG。重組融合蛋白scFv-EGFP不含有6×His標(biāo)簽。其他菌株的純化結(jié)果與6號(hào)菌株的純化結(jié)果相似,表明終止密碼子在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因酵母之前出現(xiàn)。(9)根據(jù)(7)和(8)的結(jié)果,我們使用離子交換樹脂DEAE(DE-52)來純化重組融合蛋白scFv-EGFP。將破碎的巴斯德畢赤酵母GS115 scFv-EGFP 6菌株上清液上柱,用40mM Tris-HCl(pH6.5)平衡。通過超過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pI)的1-2M NaCl緩沖液(pH 5.31)作為洗脫蛋白質(zhì),并測(cè)量280nm處的吸光度。最大吸收峰出現(xiàn)在管1中。根據(jù)管2-9的級(jí)分樣品的SDS-PAGE分析顯示,特異性條帶接近54.6kDa(scFv-EGFP的理論分子量)帶蛋白分別占62.3%,50.1%,28.8%,28.8%,17.7%,15.4%,7.4%,17.9%。此外,除了54.6kDa的蛋白質(zhì)條帶外,還存在其他蛋白質(zhì)條帶。(10)為了檢測(cè)scFv-EGFP融合蛋白對(duì)胰島素原的敏感性,我們使用scFv-EGFP檢測(cè)不同濃度的人胰島素原(4.1ng/ml,4.5ng/ml,5.9ng/ml和8.6ng/ml)(7.9ng/ml)并顯示出良好的點(diǎn)熒光。陰性對(duì)照(大腸桿菌BL21(DE3))未顯示暴露信號(hào)或熒光,這表明重組融合蛋白scFv-EGFP與人胰島素原具有特異性結(jié)合。
【學(xué)位授予單位】：蘭州理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R446.61

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本文編號(hào)：2599594