【摘要】：隨著人口老齡化進程的加劇,癌癥已經(jīng)成為威脅人類健康的“頭號殺手”。靈敏可靠的檢測手段是實現(xiàn)腫瘤等重大疾病早期診斷,把握最佳治療時機,提高治愈率的神兵利器。近年來,隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)和納米技術(shù)的迅猛發(fā)展,各種新興的分析技術(shù)不斷涌現(xiàn)。免疫分析技術(shù)憑借其操作簡單,對分析儀器要求不高且費用低廉等優(yōu)勢,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病標志物分析檢測。本論文基于生物酶和納米材料來構(gòu)建性能良好的高分辨和雙信號的檢測方法,致力于提高免疫分析的靈敏度,同時通過多指標特征值定量檢測目標物,提高分析體系的可靠性和準確性。本論文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1、脲酶介導(dǎo)的高分辨比色免疫分析方法的構(gòu)建及性能研究傳統(tǒng)的比色免疫分析方法通常是基于單一的從淺到深或從深到淺的顏色變化,當檢測目標物濃度相近時,顯色結(jié)果很難用肉眼區(qū)分,裸視的分辨率低。為解決這一難點,我們提出通過脲酶催化尿素水解致使溶液的pH升高并引起酸堿指示劑的顏色變化,進而實現(xiàn)目標物濃度依賴的多色高分辨信號的產(chǎn)生。實驗中酸堿指示劑苯酚紅作為顯色劑,Ag~+作為脲酶抑制劑,我們通過堿性磷酸酶(ALP)催化抗壞血酸酯(AAO)的水解產(chǎn)生抗壞血酸(AA),進而引起Ag~+的還原并解除對脲酶的抑制作用;脲酶催化尿素水解產(chǎn)生的氨使指示劑苯酚紅在pH 6.6~8.0范圍內(nèi)由黃色變?yōu)槌壬僮優(yōu)榧t色,實現(xiàn)了裸眼的定性和半定量檢測,同時可以通過紫外可見分光光度計或手機拍照實現(xiàn)定量檢測分析。本系統(tǒng)以兔免疫球蛋白(R IgG)為模型分析物,通過“三明治”夾心法將ALP修飾的特異性識別抗體引入檢測體系,再通過上述顯色體系實現(xiàn)定性或定量檢測。具體地:當R IgG的濃度增加時,ALP將催化產(chǎn)生的更多的AA來還原Ag~+,生成的銀單質(zhì)失去了抑制脲酶活性的功能,使脲酶催化尿素產(chǎn)生更多的氨氣,引起溶液pH升高和顏色由黃色向橙色和紅色轉(zhuǎn)變。通過模擬臨床樣本我們實現(xiàn)了在人血清中檢測R IgG,驗證了該方法在實際應(yīng)用中的潛力。結(jié)果顯示即使在10%的人血清中存在許多干擾分子,但該實驗仍可以有效地識別和捕獲R IgG,實現(xiàn)高選擇性和特異性目標物檢測。在最佳條件下,R IgG的線性檢測范圍為0-18ng mL~(-1),最低檢測限為1.73 ng mL~(-1)。該比色結(jié)果直接使用智能手機獲取圖片,然后使用軟件Image J進行定量分析,避免了昂貴而笨重的桌面設(shè)備的使用。2、基于鐵基金屬有機框架材料(Fe-MOFs)的雙信號免疫分析方法構(gòu)建及機理研究本實驗采用溶劑熱法制備了具有發(fā)光特性和類氧化酶活性的Fe-MOFs,其中有機配體為2-氨基對苯二甲酸(BDC-NH_2)。我們利用Fe-MOFs的固有特性構(gòu)建了一種基于AA誘導(dǎo)發(fā)光增強和顏色抑制的新型雙信號(發(fā)光和比色)免疫分析方法。本實驗中,Fe-MOFs作為響應(yīng)型熒光探針和催化TMB氧化顯色的類酶,為檢測體系提供熒光和比色兩種檢測信號。雙信號的變化很容易通過控制AA的濃度進行調(diào)節(jié),而AA的含量又通過免疫反應(yīng)引入的ALP進行催化調(diào)節(jié)�；谏鲜鲈瓌t,首先我們使用Fe-MOFs作為熒光探針檢測AA,實現(xiàn)了最低檢測限為0.051μM的超靈敏檢測。我們進一步將上述信號產(chǎn)生策略與酶聯(lián)免疫分析相結(jié)合,實現(xiàn)了人前列腺癌特異抗原(PSA)的高靈敏和高特異性檢測。當系統(tǒng)中存在PSA時,ALP標記的抗體通過抗原抗體的特異性結(jié)合引入到酶標板上,隨之催化AAO產(chǎn)生AA并誘導(dǎo)Fe-MOFs呈現(xiàn)熒光增強的現(xiàn)象,同時AA也將抑制Fe-MOFs催化TMB生成藍色的oxTMB,最終產(chǎn)生的熒光和比色雙信號通過全波長酶標儀進行定量測試。在人血清中檢測PSA,檢測限為180 pg mL~(-1),遠遠低于正常人血液中PSA的含量,具有在實際檢測中的應(yīng)用價值。本工作首次提出了AA誘導(dǎo)Fe-MOFs發(fā)光增強現(xiàn)象,并通過一系列實驗解釋了其作用機制。與游離的有機配體(BDC-NH_2)相比,由于配體與金屬離子間的電荷轉(zhuǎn)移(LMCT)和吸收猝滅作用,材料的發(fā)光性能明顯較弱。當Fe-MOFs遇AA后,由于鐵離子的價態(tài)變化和LMCT的部分中斷致使BDC-NH_2熒光恢復(fù),實現(xiàn)熒光從弱到強。當與AA反應(yīng)后,LMCT的UV-vis吸收峰消失以及Fe-MOFs的Fe 2p結(jié)合能降低,進一步證實了之前的推測。綜上所述,本課題基于脲酶和Fe-MOFs開發(fā)了兩種應(yīng)用于腫瘤標志物檢測的新型高分辨比色和多信號免疫分析法,在模擬生物醫(yī)學(xué)樣本的檢測中,實現(xiàn)了高靈敏度、高特異性的檢測結(jié)果。另外,上述基于酶聯(lián)免疫開發(fā)的檢測方法同樣適用于其他生物大分子或小分子的檢測。該類新型可視化免疫分析方法不僅具有良好的商業(yè)應(yīng)用前景,同時為生物檢測領(lǐng)域的發(fā)展提供了新的解決思路。
【圖文】：

高親和力和高特異性保證了免疫分析的高選擇性和高的靈敏度。免疫分析具有獨特的優(yōu)勢，如檢測速度快、靈敏度高、特異性強、易用性高，在不同的科學(xué)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用，同時展示了越來越廣闊的應(yīng)用前景。根據(jù)免疫分析信號的類型，免疫分析可分為電化學(xué)免疫分析、壓電免疫分析、磁學(xué)免疫分析和光學(xué)免疫分析。1.1.1 電化學(xué)免疫分析電化學(xué)免疫分析法是目前手持式免疫化學(xué)檢測中一種很有前途的方法。電化學(xué)免疫分析的原理如圖 1-1 所示[2]，它利用固定的識別探針選擇性地結(jié)合目標物或分析物分子，溶液中探針捕獲目標物，并通過檢測表面上局部的電信號變化來達到檢測的目的�；陔娀瘜W(xué)生物分析的工作原理，電化學(xué)分析方法是將化學(xué)信息轉(zhuǎn)換成可測量的電學(xué)信號，包括伏安信號、電位信號、電導(dǎo)信號或阻抗信號。與傳統(tǒng)的免疫分析方法相比，電化學(xué)免疫分析方法具有簡單易行、攜帶方便、可進行現(xiàn)場、實時、自動化檢測等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療護理、環(huán)境檢測和食品安全的檢測中。電子器件的低成本和大規(guī)模生產(chǎn)是電化學(xué)方法更適合于高通量商業(yè)化分析的另一個原因。

圖 1-2 基于石墨烯納米片同時檢查癌胚抗原和甲胎蛋白的免疫電化學(xué)電化學(xué)免疫傳感原理圖[6].2 壓電免疫分析Sauerbrey 是第一個提出壓電效應(yīng)的人，并推導(dǎo)出公式（如圖 1-3 所示）證明了頻率化是由增加的質(zhì)量引起的[7]。在所有能夠測量表面質(zhì)量變化的物理傳感器中，壓電是一個經(jīng)濟有效的替代品。許多類型的材料（石英、電氣石、鈮酸鋰或鉭酸鋰、定化鋅或氮化鋁）都表現(xiàn)出壓電效應(yīng)，但石英的特性使其成為分析應(yīng)用中最常見的晶料。壓電免疫分析是采用石英晶體作為傳感器元件(石英晶體微天平)，在微重力模工作，具有成本效益高、檢測直接、實驗簡單、輸出實時等優(yōu)點。在 20 世紀 90 年壓電分析方法被認為不如其他類型的分析方法靈敏。然而，隨著壓電傳感器功能理完善和許多成功應(yīng)用的報道，這種情況發(fā)生了改變。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：O657.3;R446.6

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