【摘要】：目的本課題擬探討肺炎克雷伯菌生物膜形成能力與耐藥的相關(guān)性,多重耐藥肺炎克雷伯菌外排泵基因的分布情況以及外排泵基因acrA在生物膜內(nèi)的表達(dá)情況,以及外排泵抑制劑羰酰氰間氯苯腙(carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone,CCCP)對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜形成影響。深入了解肺炎克雷伯菌生物膜耐藥機(jī)制,為有效防控肺炎克雷伯菌感染提供科學(xué)依據(jù)。方法1.收集西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2017年1月至2017年6月臨床感染患者樣本中分離的61株非重復(fù)肺炎克雷伯菌。利用MicroScan WalkAway 96 Plus全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行鑒定,對(duì)標(biāo)本來源和科室分布進(jìn)行分析,并分析其耐藥譜。2.結(jié)晶紫染色法和共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)法評(píng)價(jià)肺炎克雷伯菌形成生物膜能力,分析肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的強(qiáng)弱與耐藥的相關(guān)性。3.隨機(jī)抽取16株生物膜形成能力不同的菌株,繪制肺炎克雷伯菌生物膜生長(zhǎng)曲線,微量肉湯稀釋法檢測(cè)這16株菌對(duì)頭孢吡肟、阿米卡星、環(huán)丙沙星、亞胺培南、多粘菌素B最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)以及最低生物膜清除濃度(Minimal biofilm eradicate concentration,MBEC),分析MIC、MBEC與其生物膜形成能力的相關(guān)性。4.用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術(shù)檢測(cè)28株多重耐藥肺炎克雷伯菌外排泵基因acrA、emrB、oqxA、qacEΔ1攜帶情況,并運(yùn)用(reversetranscription-PCR,RT-PCR)技術(shù)分析acrA基因陽性菌株在生物膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)的表達(dá)情況。5.結(jié)晶紫染色法分析不同濃度的外排泵抑制劑CCCP對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜形成的影響。結(jié)果1.61株肺炎克雷伯菌臨床分離菌株中,主要來自于血液34株,占55.74%,其次是痰16株,占26.22%,分泌物8株,占13.11%,尿液3株,占4.92%。臨床科室分布以ICU病房檢出率最高,為21.31%,其次是呼吸科病房,檢出率為13.11%。檢出多重耐藥肺炎克雷伯菌(Multi-drug resistant acinetobacter klebsiella pneumoniae,MDR-Kpn)28株,檢出率為45.9%(28/61),非多重耐藥菌33株,檢出率54.1%(33/61)。MDR-Kpn對(duì)包括氨芐西林、頭孢唑林等13種抗菌藥物耐藥率在50%以上,僅對(duì)美羅培南,亞胺培南,厄他培南,阿米卡星和頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率低。將MDR-Kpn(n=28)與非MDR-Kpn(n=33)兩組對(duì)23種抗菌藥物的耐藥率進(jìn)行比較,MDR-Kpn對(duì)除氨芐西林、美羅培南、亞胺培南、厄他培南、阿米卡星和頭孢哌酮/舒巴坦外的17種抗菌藥物的耐藥率均明顯高于非MDR-Kpn菌株(P0.05)。2.61株菌中,只有Kpn216、Kpn225兩株菌不能形成生物膜,生物膜陽性率為96.72%,其中,生物膜強(qiáng)陽性的14株,陽性27株,弱陽性18株,多重耐藥菌與非多重耐藥菌生物膜形成能力無明顯差異(P0.05)。3.隨機(jī)選擇生物膜形成能力強(qiáng)的8株菌和生物膜形成能力弱的8株菌,檢測(cè)生長(zhǎng)曲線,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌之間生長(zhǎng)率的差異不明顯,說明肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的不同并非由于細(xì)菌生長(zhǎng)率的不同造成。定量檢測(cè)16株菌對(duì)頭孢吡肟、阿米卡星、環(huán)丙沙星、亞胺培南、多粘菌素B的最低抑菌濃度以及最低生物膜清除濃度,結(jié)果是Kpn形成生物膜后,對(duì)不同抗菌藥物的耐藥能力均有所增長(zhǎng),對(duì)頭孢吡肟,MIC為4-64ug/ml,MBEC為320-2560ug/ml,增幅為20-640倍。對(duì)阿米卡星,MIC為1-16ug/ml,MBEC為80-5120ug/ml,增幅為40-5120倍。對(duì)環(huán)丙沙星,MIC為0.25-8ug/ml,MBEC為40-5120ug/ml,增幅為80-5120倍。對(duì)亞胺培南,MIC為0.25-16ug/ml,MBEC為160-2560ug/ml,增幅為80-5120倍。對(duì)多粘菌素B,MIC為0.5-2ug/ml,MBEC為2-512ug/ml,增幅為4-512倍。經(jīng)過分析,不同菌株MIC值與MBEC值對(duì)頭孢吡肟(r=0.628,p=0.01)、環(huán)丙沙星(r=0.81,p=0.0001)存在正相關(guān)性,即菌株MIC值越大,形成生物膜后的MBEC值越大。對(duì)多粘菌素B(r=0.319,p=0.229),阿米卡星(r=0.441,p=0.088)和亞胺培南(r=0.079,p=0.769)并無相關(guān)性。4.28株MDR-Kpn外排泵基因的檢測(cè)中,emrB基因陽性25株,陽性率最高,為89.29%,其次是oqxA基因陽性22株,陽性率為78.57%,qacEΔ1基因陽性11株,陽性率39.29%,acrA基因陽性10株,陽性率35.71%。28株菌只Kpn215未檢出外排泵基因,只攜帶一種外排泵基因的有4株,占14.29%,同時(shí)攜帶2種外排泵基因的有8株,占28.57%,同時(shí)攜帶3種外排泵基因的有12株,占42.86%,同時(shí)攜帶4種外排泵基因的有5株,占17.86%。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析,菌株攜帶外排泵基因種類的多少與其生物膜形成能力并無明顯相關(guān)性(P0.05),4種外排泵基因陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后與GenBank中的已提交的相應(yīng)基因序列的同源性均≥98%。5.隨機(jī)選取6株acrA基因陽性的肺炎克雷伯菌,對(duì)比生物膜狀態(tài)與浮游狀態(tài)下acrA基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)生物膜狀態(tài)下acrA基因表達(dá)存在不同程度的上調(diào),最高上調(diào)倍數(shù)達(dá)78倍。證明生物膜的形成能夠促進(jìn)外排基因acrA的表達(dá)。6.當(dāng)外排泵抑制劑CCCP濃度在1.25-10μg/ml時(shí),能夠不同程度促進(jìn)肺炎克雷伯菌生物膜形成。結(jié)論1.多重耐藥肺炎克雷伯菌檢出率較高,MDR-Kpn僅對(duì)美羅培南、亞胺培南、厄他培南、阿米卡星和頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率低,能夠作為肺炎克雷伯菌感染的治療用藥。2.肺炎克雷伯菌生物膜陽性檢出率高,多重耐藥菌與非多重耐藥菌生物膜形成能力無明顯差異,肺炎克雷伯菌形成生物膜后的耐藥能力均大幅度增加,對(duì)頭孢吡肟和環(huán)丙沙星的MIC值與MBEC值存在正相關(guān)性。3.MDR-Kpn菌株外排泵基因檢出率較高,大多攜2種或2種以上外排泵基因,生物膜的形成能夠促進(jìn)外排泵基因acrA的表達(dá)。4.外排泵抑制劑CCCP低于工作濃度時(shí)能夠不同程度促進(jìn)肺炎克雷伯菌生物膜的形成。
【圖文】：

株 MBEC 值判定 96 孔板置于黑色背景處，讀取無渾濁培養(yǎng)孔的抗菌藥物濃度即BEC 值。結(jié)果株標(biāo)本類型和科室來源 菌株標(biāo)本類型 株肺炎克雷伯菌臨床分離菌株中，主要來自于血液 34 株，占 55.7痰 16 株，占 26.22%，分泌物 8 株，占 13.11%，尿液 3 株，，占 4.-1。

圖 1-2 61 株肺炎克雷伯菌菌株科室分布情況Fig.1-2 The distribution of 61 strains of Klebsiella pneumoniae strains1.2.2 臨床分離 61 株肺炎克雷伯菌的耐藥譜檢測(cè)結(jié)果根據(jù) 61 株肺炎克雷伯菌對(duì) 23 種抗菌藥物的藥敏結(jié)果，對(duì) 3 類及 3 類以上抗菌藥物耐藥的菌株視為多重耐藥肺炎克雷伯菌(Multi-drug resistantacinetobacter klebsiella pneumoniae , MDR-Kpn),61 株肺炎克雷伯菌中，檢出多重耐藥菌 28 株，檢出率為 45.9%（28/61），非多重耐藥菌 33 株，檢出率 54.1%（33/61）。臨床分離的 61 株肺炎克雷伯菌對(duì)氨芐西林耐藥率最高，達(dá) 100%，對(duì)哌拉西林，頭孢唑啉，頭孢呋辛，復(fù)方新諾明，四環(huán)素，頭孢噻肟，頭孢吡肟，頭孢他啶，氨曲南，頭孢曲松的耐藥率超過 30%，對(duì)美
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R446.5

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本文編號(hào)：2594739