【摘要】：尿酸(Uric Acid,UA)是嘌呤代謝的終產(chǎn)物。當(dāng)其在人體內(nèi)生成過(guò)多或者排泄減少時(shí),會(huì)使血清中的尿酸含量過(guò)高,形成高尿酸血癥(Hyperuricemia)和痛風(fēng)(Gout)。目前針對(duì)高尿酸血癥及痛風(fēng)的主要治療手段是利用藥物抑制尿酸生成和促進(jìn)尿酸排泄。然而,藥物治療易引發(fā)急性痛風(fēng)并存在效果不明顯、超敏、耐藥等缺點(diǎn),急需一種新的治療手段來(lái)治療高尿酸血癥,減輕患者的痛苦并降低引發(fā)其他疾病的風(fēng)險(xiǎn)。合成生物學(xué)中利用基因回路設(shè)計(jì)思想,將各種功能元件進(jìn)行組裝,自下而上的形成功能回路,實(shí)現(xiàn)研究人員的設(shè)定目標(biāo)。本研究中我們將尿酸感應(yīng)元件組裝成基因回路,利用基因治療中所提供的慢病毒載體,將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為載體細(xì)胞,期望實(shí)現(xiàn)基因回路在動(dòng)物水平上對(duì)血清尿酸的調(diào)控。本研究主要包括以下幾個(gè)方面:(1)從GenBank中查得調(diào)控元件mUTs、hucO8以及smUox的序列,利用內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)IRES序列進(jìn)行串聯(lián),形成2,700 bp左右的基因回路mUTs-IRES-huc08-smUox(簡(jiǎn)稱MHS),并對(duì)其進(jìn)行全基因合成。酶切鑒定結(jié)果表明成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-MHS載體。研究通過(guò)在細(xì)胞水平上對(duì)尿酸酶的表達(dá)、環(huán)境中尿酸濃度的變化來(lái)評(píng)價(jià)MHS的調(diào)控功能。隨后建立大鼠高尿酸模型,通過(guò)含基因回路的細(xì)胞治療,在動(dòng)物水平上對(duì)其調(diào)控功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。(2)基因回路導(dǎo)入間充質(zhì)干細(xì)胞需要借助高效、安全的慢病毒載體。以pIRES2-EGFP-MHS載體為模板,PCR釣取目的基因序列,用In-fusion的方法成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體LV-MHS。利用對(duì)照慢病毒LV-EGFP載體,分別從轉(zhuǎn)染試劑、脂質(zhì)體與DNA比例、轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、病毒收獲培養(yǎng)基以及表達(dá)質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒之間的比例等條件來(lái)確定慢病毒包裝的最佳條件。最終確定的慢病毒最佳包裝條件為:選用Lip3000作轉(zhuǎn)染試劑,脂質(zhì)體與DNA比例(μL:μg)為1.5:1,包裝質(zhì)粒LV-EGFP:pGP:pVSVG的摩爾比例為1:1:1,此外,在轉(zhuǎn)染前2h和轉(zhuǎn)染后6 h,需要分別更換一次含有10%FBS的完全培養(yǎng)基。(3)采用最佳包裝條件分別對(duì)對(duì)照慢病毒LV-EGFP、目的慢病毒LV-MHS進(jìn)行包裝,超速離心法濃縮純化病毒上清液,并利用熒光觀察法檢測(cè)滴度。最終檢測(cè)結(jié)果表明包裝所得的LV-EGFP滴度為4× 108 TU/mL,目的慢病毒LV-MHS滴度為2×106 TU/mL。(4)采用組織塊分離的方法從人臍帶中分離間充質(zhì)干細(xì)胞,擴(kuò)增培養(yǎng)后后分別從細(xì)胞形態(tài)、成骨成脂分化特性以及表面標(biāo)記檢測(cè)三個(gè)方面進(jìn)行鑒定。(5)使用滴度為2× 106 TU/mL的對(duì)照慢病毒分別從添加感染增強(qiáng)液Enhance、添加助感染試劑Polybrene、增加感染體積以及重復(fù)感染等方式對(duì)慢病毒感染間充質(zhì)細(xì)胞的條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示,在完全培養(yǎng)基中添加10 μg/mL Polybrene,使用60 μL滴度為2×106 TU/mL的對(duì)照慢病毒連續(xù)感染3次,可以對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生較好的感染效果。(6)采用最佳感染條件使用目的慢病毒LV-MHS感染MSCs。顯微鏡下可以觀察到成功感染的細(xì)胞,感染效率達(dá)到10.7%。在此條件下,添加1000 μM尿酸48 h后可以將培養(yǎng)基中的尿酸有效降低至817 μM左右,尿酸清除率達(dá)到1 8.23士3.39%。本研究以合成生物學(xué)的基因回路原理為基礎(chǔ),結(jié)合基因治療和干細(xì)胞治療,旨在為高尿酸血癥提供一個(gè)新的治療思路。構(gòu)建含尿酸調(diào)控基因回路的表達(dá)載體,并分別從細(xì)胞和動(dòng)物水平上評(píng)價(jià)其對(duì)環(huán)境中尿酸的調(diào)控作用。構(gòu)建含基因回路的慢病毒表達(dá)載體LV-MHS,確立最佳的慢病毒包裝條件及對(duì)MSCs的最佳感染條件。最終實(shí)現(xiàn)目的慢病毒LV-MHS對(duì)MSCs感染效率為10.7%,能將環(huán)境中的尿酸濃度從1000μM降低至817 μM左右,尿酸清除率達(dá)到18.23±3.39%。本研究實(shí)現(xiàn)基因回路到間充質(zhì)干細(xì)胞的有效遞送,并初步探究其在MSCs中對(duì)尿酸的調(diào)控作用用,從而為基因回路動(dòng)物水平上對(duì)尿酸的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

逡逑圖１．邋１同步循環(huán)裂解及藥物釋放示意圖：ｌｌ：逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ邋ｃｙｃｌｉｃａｌ邋ｌｙｓｉｓ邋ａｎｄ邋ｄｒｕｇ邋ｒｅｌｅａｓｅ逡逑除了細(xì)菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞也被用作生物底物，在轉(zhuǎn)基因控制元件基礎(chǔ)上，創(chuàng)逡逑建基因網(wǎng)絡(luò)來(lái)監(jiān)測(cè)體內(nèi)代謝物的病理水平，用來(lái)作出基于細(xì)胞的診斷和治療。逡逑Ｘｕｅ等［１２］在ＨＥＫ２９３細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建感應(yīng)齊墩果酸的基因回路，控制ｓｈＧＬＰ－ｌ的表逡逑達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)小鼠血糖降低（圖１．２）。人為改造Ｔ細(xì)胞，使其靶向細(xì)胞表面抗原，逡逑從而特定殺死腫瘤細(xì)胞的ＣＡＲ－Ｔ技術(shù)，是合成基因回路在哺乳動(dòng)物細(xì)胞治療中逡逑的重要應(yīng)用［１３］。８１１？＾八等［１４］在ＨＥＫ細(xì)胞中構(gòu)建了一個(gè)合成回路，通過(guò)炎癥細(xì)逡逑胞因子將ＮＦ－ｋＢ的激活重定向到驅(qū)動(dòng)細(xì)胞。通過(guò)合成的ＮＦ－ｋＢ反應(yīng)性啟動(dòng)子啟逡逑動(dòng)炎癥中和劑的表達(dá)，緩解急性小鼠結(jié)腸炎的癥狀。？＾：＾丨１１１１＾等［１５］構(gòu)建了由癌癥逡逑特異性啟動(dòng)子激活的合成電路

建基因網(wǎng)絡(luò)來(lái)監(jiān)測(cè)體內(nèi)代謝物的病理水平，用來(lái)作出基于細(xì)胞的診斷和治療。逡逑Ｘｕｅ等［１２］在ＨＥＫ２９３細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建感應(yīng)齊墩果酸的基因回路，控制ｓｈＧＬＰ－ｌ的表逡逑達(dá)，，從而實(shí)現(xiàn)小鼠血糖降低（圖１．２）。人為改造Ｔ細(xì)胞，使其靶向細(xì)胞表面抗原，逡逑從而特定殺死腫瘤細(xì)胞的ＣＡＲ－Ｔ技術(shù)，是合成基因回路在哺乳動(dòng)物細(xì)胞治療中逡逑的重要應(yīng)用［１３］。８１１？＾八等［１４］在ＨＥＫ細(xì)胞中構(gòu)建了一個(gè)合成回路，通過(guò)炎癥細(xì)逡逑胞因子將ＮＦ－ｋＢ的激活重定向到驅(qū)動(dòng)細(xì)胞。通過(guò)合成的ＮＦ－ｋＢ反應(yīng)性啟動(dòng)子啟逡逑動(dòng)炎癥中和劑的表達(dá)，緩解急性小鼠結(jié)腸炎的癥狀。？＾：＾丨１１１１＾等［１５］構(gòu)建了由癌癥逡逑特異性啟動(dòng)子激活的合成電路，使其僅能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)多種免疫刺激因子，逡逑從而對(duì)免疫細(xì)胞敏感。在癌鼠模型中注射編碼這些電路的慢病毒載體可以觸發(fā)有逡逑效的抗腫瘤反應(yīng)。這為癌癥治療提供了一種新的選擇。逡逑Ｖ邋＾邋Ｅ，ｔｎａ逡逑邐＾邐Ｏ�。�？邋丨�。悖悖祝茫族义希掊澹龋殄鍨剘|邋Ａｄ？ｎＷｙｌｅｙｃｌ＊Ｍ邐ｖ逡逑ｔｉｉｌＨｌ邋ｊｔ邐＼逡逑ｗ邋ＧＰＢＡＲ１邐Ｐ邐邐邐邋＼逡逑＼邐ＡＴＰ逡逑＼邋ＰＫＡ逡逑＼邐Ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ｓｕｂｕｎｉｔ邋邋邋＾邐Ｉ逡逑）邐ｉ邐／逡逑（—＾邐邋邋Ｃ＾ａｒ邐／逡逑Ｐ邋—邋ＧＰＢＡＲ１邋ｐＡ邐ＴｏｔＲ邐／逡
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R450

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本文編號(hào)：2592698