【摘要】：目的:腸球菌是醫(yī)院感染的重要病原菌,目前為止,腸球菌利奈唑胺已知的耐藥機(jī)制主要包括23S rRNA的V區(qū)突變,L3、L4核糖體蛋白氨基酸突變以及甲基化轉(zhuǎn)移酶基因cfr介導(dǎo)耐藥。然而,以上機(jī)制不能解釋低水平利奈唑胺耐藥腸球菌(MIC:4-16 mg/L)機(jī)制。為完善低水平利奈唑胺耐藥糞腸球菌機(jī)制尋找新的耐藥靶點(diǎn),本研究首先對(duì)此類低水平耐藥糞腸球菌采用Illumina HiSeq 4000高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選出與耐藥相關(guān)的基因及通路。隨后對(duì)2014年至2017年重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的利奈唑胺耐藥糞腸球菌臨床分離株的耐藥機(jī)制及流行特征進(jìn)行分析。方法:1.本研究采用我院檢驗(yàn)科分離的一株低水平利奈唑胺耐藥糞腸球菌(P10748 MIC:8 mg/L)和一株利奈唑胺敏感糞腸球菌(3138 MIC:2 mg/L)進(jìn)行Illumina HiSeq 4000高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析,標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212作為質(zhì)量評(píng)估。利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋與富集分析,并利用熒光定量PCR對(duì)測(cè)序中的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。2.我們收集了2014年到2017年我院檢驗(yàn)科微生物室共1120株糞腸球菌,根據(jù)美國(guó)CLSI標(biāo)準(zhǔn)篩選出43株利奈唑胺耐藥糞腸球菌菌株(MIC≥8 mg/L)。采用微量肉湯稀釋法測(cè)定利奈唑胺對(duì)以上菌株的最低抑菌濃度(MIC),應(yīng)用基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)其可能存在的耐藥機(jī)制包括23S rRNA的V區(qū)、核糖體蛋白L3和L4、optrA基因以及cfr基因,并與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212及人源糞腸球菌E349菌株進(jìn)行核苷酸序列相似性比對(duì),分析基因突變與耐藥的相關(guān)性。利用多位點(diǎn)序列分型(MLST)探究利奈唑胺耐藥糞腸球菌間的同源性及分子流行特點(diǎn)。結(jié)果:1.測(cè)序共獲得了3.57 Gb有效數(shù)據(jù),通過De novo拼接獲得1,920條unigenes,總長(zhǎng)度為2,122,210 bp,平均長(zhǎng)度為1,105 bp。差異基因模式聚類分析顯示共有150個(gè)顯著性差異表達(dá)基因(FDR≤0.001,|log2 Ratio|≥1),其中141個(gè)上調(diào),9個(gè)下調(diào)。生物膜形成和外排泵相關(guān)基因esp、optrA、fexA在耐藥菌中顯著上調(diào)。GO功能注釋結(jié)果顯示,催化活性、代謝過程和細(xì)胞是注釋最多的條目;Pathway富集分析發(fā)現(xiàn),肽聚糖生物合成、纈氨酸亮氨酸和異亮氨酸的降解和硫代謝為顯著性富集通路(p0.05)。熒光定量PCR對(duì)差異表達(dá)基因的驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果的趨勢(shì)基本一致。2.利用微量肉湯稀釋法對(duì)43株糞腸球菌的利奈唑胺藥敏檢測(cè)顯示MIC范圍在8-16 mg/L,其中32株(MIC:16 mg/L)剩余11株(MIC:8mg/L)。43株利奈唑胺耐藥糞腸球菌株均未發(fā)現(xiàn)23S rRNA V區(qū)突變,也未檢出cfr基因,所有菌株均檢測(cè)出optrA基因。與糞腸球菌E349的OptrA蛋白相比,我們發(fā)現(xiàn)8株糞腸球菌在Glu60Lys和Gly197Asp位置有新的氨基酸取代。有4株糞腸球菌的核糖體蛋白L3檢測(cè)出一個(gè)新的突變位點(diǎn)Ser113Leu;有31株核糖體蛋白L4檢測(cè)出一個(gè)新的缺失和三個(gè)新的點(diǎn)突變,包括Thr35Ala,Ile98Val,Asn79Asp替換和Gln103缺失,但并未發(fā)現(xiàn)突變與MIC的直接關(guān)系。3.采用多位點(diǎn)序列分型(MLST)分型顯示,43株利奈唑胺耐藥糞腸球菌被分為20個(gè)ST型,其中以ST16為主有14株;ST69有4株;ST632有3株;ST480有3株。其中有9株我們發(fā)現(xiàn)了新的ST型ST823至ST830,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了新的等位基因gki95。未出現(xiàn)克隆復(fù)合體,分離株之間沒有克隆相關(guān)性。結(jié)論:1.推測(cè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OptrA和與生物膜形成相關(guān)的腸球菌表面蛋白Esp可能在耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用,這為低水平利奈唑胺耐藥腸球菌機(jī)制提供了可參考的耐藥靶標(biāo)。2.optrA基因在耐利奈唑胺糞腸球菌呈現(xiàn)出高攜帶率,它在低水平利奈唑胺耐藥機(jī)制中具有重要作用,其可能是低水平利奈唑胺耐藥糞腸球菌的良好預(yù)測(cè)標(biāo)志物。3.我院2014-2017年分離的低水平利奈唑胺耐藥腸球菌的感染病例呈現(xiàn)散發(fā)性而不是暴發(fā)性。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉曉軍;陳重;李多云;程航;鄧向斌;鄧名貴;潘偉光;楊唯枝;王紅燕;姚偉明;余治健;鄧啟文;;利奈唑胺誘導(dǎo)糞腸球菌耐藥50S核糖體蛋白突變位點(diǎn)分析[J];中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué);2015年03期

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1 高睿;糞腸球菌對(duì)利奈唑胺低水平耐藥機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

2 張曉飛;分枝桿菌的質(zhì)譜分型及其對(duì)利奈唑胺耐藥機(jī)制的研究[D];浙江工業(yè)大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：2592728