【摘要】：目的:縮窄性心包炎(Constrictive Pericarditis,CP)是指多種原因所致的心包纖維性增厚、鈣化,使心臟舒張期充盈受限,靜脈回流受阻而引起的一系列綜合征。CP病程長者可使心肌發(fā)生廢用性萎縮、心肌纖維化(Myocardial Fibrosis,MF),最終可發(fā)展成心力衰竭。Sengupta等研究發(fā)現(xiàn)CP患者心臟圓周形變能力減低、扭轉(zhuǎn)和解旋能力下降;同樣,我們利用二維斑點追蹤顯像(Speckle-tracking Imaging,STI)技術(shù)對CP患者左室心肌旋轉(zhuǎn)功能觀察,發(fā)現(xiàn)患者心尖水平心外膜下心肌旋轉(zhuǎn)角度及整體旋轉(zhuǎn)角度較正常人明顯減低,這種收縮功能減低在一定程度上跟心肌的纖維化有關(guān)。但CP患者心肌纖維化的規(guī)律及機制尚不明確,心肌成纖維細胞(Cardiac Fibroblasts,CFs)的細胞間通訊在縮窄性心包炎心肌纖維化發(fā)病機制中起著重要作用,有研究報道多種microRNAs(miRNAs)與心肌成纖維細胞存活和相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。本研究旨在探討心肌纖維化心肌中miRNAs的表達及其調(diào)控靶基因活化情況,更好地了解CP心肌纖維化分子機制及發(fā)現(xiàn)新的早期干預(yù)靶點。研究方法:1.制備Wistar大鼠縮窄性心包炎模型,從大體及病理切片觀察動物模型是否建立成功,造模成功后,收集心肌組織,應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析心肌纖維化心肌中miRNAs的表達情況。2.制備Wistar大鼠縮窄性心包炎不同病程模型,30只大鼠隨機分為三組:模型16W組(CP16W),模型8W組(CP8W),對照組(N),每組10只。檢測MicroRNA-146a(miR-146a)的表達隨病程的變化;應(yīng)用STI評價大鼠左心室心肌功能的變化,評價心肌功能改變與心肌纖維化的相關(guān)性。3.應(yīng)用CP大鼠模型心臟標本,實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)檢測縮窄性心包炎大鼠心肌中miR-146a靶基因Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)的下游基因白細胞介素1受體相關(guān)激酶1(IL-1 receptor-associated kinase 1,IRKI1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor-6,TRAF6)的mRNA表達水平。蛋白印跡試驗(Western-blot法)檢測TRL4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中IRAK1、TRAF6、核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear Factor-kappa B,NF-κB)及磷酸化核因子-κB(Phosphate Nuclear Factor-kappa B,p-NF-κB)蛋白表達水平變化。4.原代培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細胞,轉(zhuǎn)染miR-146a,應(yīng)用LPS處理,RT-PCR和Western Blot檢測下游效應(yīng)物的表達情況,驗證miRNA-146a通過TLR4信號通路調(diào)控心肌成纖維細胞功能。結(jié)果:1.在成功構(gòu)建縮窄性心包炎大鼠模型的基礎(chǔ)上,利用高通量測序法對CP模型組和對照組各3例樣本進行miRNA分析,篩選出組間差異miRNAs共34個,其中CP模型組表達上調(diào)miRNAs 17個,表達下調(diào)miRNAs 17個。MiR-146a具有最顯著的表達豐度。組織樣本進行RT-PCR檢測結(jié)果顯示:CP8W組miR-146a表達較對照組增高,CP16W組與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異,與CP8W組相比則減低,miR-146a隨病程發(fā)生動態(tài)變化。2.超聲評價心肌纖維化:與N組相比,CP8W組左室游離壁外層及中層心肌圓周應(yīng)變(Circumferential Strain,SC)減低,CP16W組左室游離壁外層、中層及內(nèi)層心肌SC均減低。與CP8W組相比,CP16W組左室游離壁中層及外層心肌SC進一步減低。CP8W組與CP16W組的縱向應(yīng)變(Longitudinal Strain,SL)變化趨勢與SC一致。與N組相比,CP8W組徑向應(yīng)變(Radial Strain,SR)無明顯變化,CP16W組左室整體及游離壁SR減低。心肌組織蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)、Masson染色及天狼星紅染色(Sirius red Staining,SR染色)見心包增厚及心肌纖維化。CP8W組大鼠模型心肌纖維化主要位于左室游離壁心外膜下心肌,CP16W組大鼠模型位于左室游離壁心肌各層。各組大鼠心肌組織纖維化指標α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白(Type I collagen,COLⅠ)、Ⅲ型膠原蛋白(TypeⅢcollagen,COLⅢ)mRNA表達較對照組增高,CP16W模型組α-SMA及COLⅠmRNA較CP8W模型組進一步增高。3.MiR-146a靶基因IRAK1、TRAF6在縮窄性心包炎大鼠模型心肌組織中的表達情況。RT-PCR及WB的結(jié)果顯示:CP8W組IRAK1和TRAF6較對照組減低,CP16W組與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異,與CP8W組相比則升高。4.與control組相比,LPS處理組IRAK1、TRAF6、p-NF-κB及α-SMA表達均增高;轉(zhuǎn)染miR146a模擬物后,與LPS組比較,IRAK1、TRAF6、p-NF-κB及α-SMA表達均減低;轉(zhuǎn)染miR-146a抑制物后,與LPS組比較,IRAK1、TRAF6、p-NF-κB及α-SMA表達均增高。結(jié)論:1.本研究應(yīng)用經(jīng)胸心包注射LPS及TP混合致炎溶液的方法成功制備了縮窄性心包炎大鼠模型。2.應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析共篩選出組間差異miRNAs 34個,其中CP模型組miR-146a具有最顯著的表達豐度。3.在CP心肌纖維化不同病程模型中,miR-146a的表達表現(xiàn)為先增高后降低的動態(tài)變化。應(yīng)用STI技術(shù)可以從縱向、徑向及圓周三個方面對CP心肌纖維化進行準確評估,動態(tài)觀察心肌纖維化是從外層心肌向內(nèi)層心肌逐漸進展的過程。4.大體及細胞研究結(jié)果證實,miR-146a表達上調(diào)具有抑制CP大鼠心肌纖維化的作用,miR-146a通過作用Toll樣受體4信號通路中的靶基因TRAF6和IRAK1來實現(xiàn)調(diào)控心肌纖維化。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文厚、藍染，陽性染色面積比顯著高于 N 組，心外膜下心肌組織間隙內(nèi)局部可見藍染(見圖 1.1C、G、J 及表 1.2)；SR 染色：光鏡觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原呈紅色、肌纖維呈淡黃色，細胞核呈藍色。N 組大鼠臟層心包呈單層、紅染；CP 組臟層心包明顯增厚、紅染，，陽性染色面積比顯著高于 N 組，心外膜下心肌組織間隙內(nèi)局部可見紅染。（見圖 1.1D、H、K 及表 1.2）

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文表 1.2 CP 大鼠模型心包厚度及陽性染色面積比比較（ x±S）分組 n臟層心包厚度(μm)MS 陽性染色面積比(%)SR 陽性染色面積(%)N 3 10.66 ±3.00 9.88 ±3.44 7.32 ±1.60CP 3 261.90 ±103.52 30.90 ±10.00 25.97 ±8.70t -4.203 -3.44 -3.65P 0.014* 0.026* 0.022*3.1.2 RT-PCR 及 Western Blot 驗證對 CP 模型組與對照組大鼠心肌組織中 α-SMA 的 mRNA 進行 RT-PCR 檢測對 α-SMA 蛋白表達進行 western blot 檢測。與對照組相比，CP 模型組 α-SMA mRNA 及蛋白表達增高。見圖 1.2
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R445.1;R542.11

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本文編號：2590007