【摘要】：第一部分以整合素αv亞基為靶點干預放射性肺纖維化的動物水平研究目的放射性肺纖維化是胸部放射治療的常見并發(fā)癥,目前仍缺乏有效的預防和治療手段。因此,針對放射性肺纖維化的研究具有重要臨床意義。TGF-β1是調(diào)節(jié)肺纖維化的關鍵因子,肌成纖維細胞是調(diào)控肺纖維化的關鍵細胞。研究表明肌成纖維細胞表達的整合素αv介導的TGF-β1活化在肝纖維化和腎纖維化中具有重要作用,而整合素αv在放射性肺纖維化中的作用尚無報道。本研究將探討以整合素αv亞基為靶點干預放射性肺纖維化的可行性。方法利用Pdgfrb-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠靶向肌成纖維細胞,構建Itgav~(loxP/loxP);Pdgfrb-Cre肌成纖維細胞整合素αv條件性敲除小鼠。給予上述轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠胸部單次16Gy照射,照射后第24周通過肺組織HE染色、Masson染色、Ashcroft纖維化評分、小動物活體CT成像、羥脯氨酸測定、組織蛋白免疫印跡分析等方法比較基因敲除型和野生型小鼠肺纖維化程度。結果野生型小鼠相比,基因敲除小鼠放射性肺纖維化程度顯著減輕。具體表現(xiàn)為與野生型小鼠相比,Itgav~(loxP/loxP);Pdgfrb-Cre基因型小鼠保有較為完整的肺組織形態(tài)結構、Ashcroft纖維化評分較低(p0.01)、膠原沉積較少、羥脯氨酸含量較低(p0.05)、α-SMA表達水平較低,且差異具有統(tǒng)計學意義。結論敲除肌成纖維細胞整合素αv基因可顯著減輕小鼠放射性肺纖維化,為臨床上以整合素αv亞基為靶點干預放射性肺纖維化提供了理論依據(jù)。第二部分整合素αv亞基通過激活TGF-β1及其下游通路促進放射性肺纖維化目的我們通過建立ItgavloxP/loxP;Pdgfrb-Cre條件性基因敲除小鼠放射性肺纖維化模型,發(fā)現(xiàn)肌成纖維細胞表達的整合素αv是放射性肺纖維化病理過程中的關鍵蛋白。研究表明,整合素αv在TGF-β1的活化中起關鍵作用。然而,整合素αv是否通過激活TGF-β1促進放射性肺纖維化的發(fā)生尚不清楚。本研究將進一步探討整合素αv在放射性肺纖維化中的作用機制。方法應用ELISA方法測定整合素αv敲除型和野生型小鼠血漿TGF-β1水平,比較照射前后血漿TGF-β1水平變化。以8Gy照射MRC-5細胞,比較照射前后整合素αv、TGF-β1下游Smad通路蛋白和纖維化指標的表達變化。應用外源性RGD多肽、TGF-β1和基因敲低技術,明確整合素αv對TGF-β1的激活作用及其作用機制。結果照射組小鼠血漿總TGF-β1水平均較對照組升高,且整合素αv敲除型與野生型小鼠兩組間無明顯差異。而照射組中敲除型小鼠血漿活化型TGF-β1水平較受照射的野生型小鼠明顯降低。MRC-5受照射后整合素αv、磷酸化Smad2/3、α-SMA和膠原的表達均上調(diào)。利用外源性RGD多肽或整合素αv基因敲低處理MRC-5可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象,導致蛋白表達的下調(diào)。進一步使用外源性活化型TGF-β1處理細胞,可逆轉(zhuǎn)外源性RGD多肽或整合素αv基因敲低所導致的蛋白表達下調(diào),而使用外源性潛在型TGF-β1處理細胞無此作用。結論整合素αv通過與RGD序列作用激活潛在型TGF-β1,從而促進放射性肺纖維化的發(fā)生。第三部分整合素基因單核苷酸多態(tài)性與放射性肺損傷的相關性研究目的放射治療在肺癌治療中具有重要地位。作為輻射誘導的正常組織并發(fā)癥,放射性肺損傷是胸部照射劑量的主要限制性因素。然而,即使放射治療的劑量學參數(shù)相同,患者發(fā)生放射性肺損傷的幾率和程度存在較大個體差異,這意味著遺傳因素可能在放射性肺損傷的發(fā)病中具有重要作用�；谇皟刹糠值难芯�,本部分將進一步在人體水平研究整合素基因單核苷酸多態(tài)性與放射性肺損傷的相關性,并建立放射性肺損傷預測模型。方法在接受放射治療的肺癌患者人群中,應用質(zhì)譜和一代測序技術對患者整合素基因單核苷酸多態(tài)性進行分型。應用Cox回歸生存分析研究整合素基因型與放射性肺損傷的相關性,應用Kaplan-Meier曲線描述聯(lián)合劑量學參數(shù)不同rs4665162基因型患者的放射性肺損傷發(fā)病風險和時間的函數(shù)關系。應用免疫組織化學分析技術比較不同基因型患者整合素蛋白表達水平的差異。根據(jù)整合素基因型、劑量學參數(shù)等因素與放射性肺損傷的相關性,建立放射性肺損傷預測模型,應用ROC曲線比較各模型的敏感度和特異性。結果Cox回歸生存分析發(fā)現(xiàn)患者年齡、照射方式、V20、MLD以及整合素rs4665162基因型與放射性肺損傷發(fā)病風險存在相關性。rs4665162 AG/GG基因型聯(lián)合劑量學參數(shù)MLD≥13.5Gy或V20≥24.1%以及未接受IMRT的患者具有最高的放射性肺損傷發(fā)病風險。免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)AG/GG基因型患者肺組織中整合素表達水平更高(p0.05)。與單純劑量學參數(shù)預測發(fā)病風險相比,聯(lián)合患者年齡、MLD、IMRT、rs4665162基因型等因素建立的放射肺損傷預測模型ROC曲線下面積最大,即具有最好的敏感度和特異性。結論整合素rs4665162基因型與放射性肺損傷發(fā)病風險存在相關性,聯(lián)合患者年齡、MLD、IMRT、rs4665162基因型等因素建立的放射性肺損傷預測模型具有較好的敏感度和特異性。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文結果1. ItgavloxP/-轉(zhuǎn)基因小鼠的構建如圖 1 所示，構建得到 ItgavloxP/-轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR 驗證目的小鼠的基因分型：使用 mItgav_F1 和 mItgav_F1 引物的 PCR 得到的條帶中 199bp 基因型為野生型，260bp基因型為 loxP site，，可見序號 25、26、27 含有 loxP 基因片段（圖 2A）；使用 mItgav_F2和mItgav_F2引物的PCR得到的條帶中203bp基因型為野生型，343bp基因型為Frt site和 loxP site，進一步驗證序號 25、26、27 含有 loxP 基因片段（圖 2B）；使用 mItgav_F3和 mItgav_F3 引物的 PCR 得到的條帶中 3.3kb 基因型為 loxP site 和 Exon of Gm13684，進一步驗證序號 25、26、27 含有 loxP 基因片段（圖 2C）。

ftgav0"P}一轉(zhuǎn)基因小鼠PCR鑒定結果
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R730.55

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本文編號：2589684