【摘要】：背景與目的:膿毒癥是嚴(yán)重?zé)齻蟪Ｒ姷牟l(fā)癥和死亡原因之一,是危重?zé)齻R床救治的難點(diǎn)和重點(diǎn)。創(chuàng)面感染是引發(fā)燒傷膿毒癥的首要原因:燒傷后皮膚這一保護(hù)屏障被破壞,微生物從創(chuàng)面入侵,壞死組織又為病原體提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境,使創(chuàng)面易于發(fā)生侵襲性感染,進(jìn)一步加重即可引發(fā)膿毒癥。研究證實(shí)燒傷膿毒癥的發(fā)生率和病死率與創(chuàng)面大小和燒傷程度明顯相關(guān)。在膿毒癥早期,炎癥與免疫反應(yīng)異常主要表現(xiàn)為全身過度炎癥反應(yīng),“炎癥風(fēng)暴”所引起的組織壞死和器官功能障礙其主要死因。膿毒癥后期免疫狀態(tài)逐步轉(zhuǎn)變?yōu)橐钥寡追磻?yīng)為主的代償性抗炎反應(yīng)綜合癥和免疫抑制,機(jī)體易于發(fā)生繼發(fā)感染和二次損傷,這也是膿毒癥后期患者的主要死亡原因。因此,創(chuàng)面炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫狀態(tài)在燒傷膿毒癥的治療和預(yù)后中有關(guān)鍵的作用。樹突狀細(xì)胞(DCs)是體內(nèi)唯一能激活初始T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞,在皮膚組織中定居著多種DCs亞群。已有研究證實(shí),膿毒癥可導(dǎo)致DCs數(shù)量和功能上的改變,是造成免疫抑制重要組成部分。但是目前,國內(nèi)外鮮見關(guān)于燒傷創(chuàng)面和免疫組織中的DCs及細(xì)胞因子的變化及其與機(jī)體免疫狀態(tài)關(guān)系的報(bào)道,本課題將針對(duì)該問題進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性研究,為燒傷創(chuàng)面膿毒癥的創(chuàng)面治療和免疫狀態(tài)調(diào)節(jié)提供幫助。方法:1.動(dòng)物分組及處理:將8~12周的雄性SPF級(jí)BalB/c小鼠隨機(jī)分為三組,對(duì)照組(sham:背部20%TBSA皮膚37℃水浴接觸9s)、燙傷組(burn:背部20%TBSA皮膚90℃水浴接觸9s)、燙傷感染組(sepsis:背部20%TBSA皮膚90℃水浴接觸9s,創(chuàng)面冷卻后在創(chuàng)面中心皮下注射銅綠假單胞桿菌1×10~6CFU/ml菌液50ul)。2.觀察三組小鼠外觀和行為特征,每24h記錄一次小鼠的生存率,記錄一周;每24h記錄一次小鼠的體重,記錄96h。3.分別檢測(cè)三組小鼠外周血血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血肌酐、血清尿素氮的含量,對(duì)比三組小鼠的肝腎功能。4.分別取三組小鼠的臟器組織(心臟、肝、脾、肺、腎),碾磨后離心取上清液,按1:10比例稀釋后吸取100ul稀釋液均勻涂抹在血培養(yǎng)板上,37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h后取出,雙人獨(dú)立計(jì)算菌落形成數(shù)量并記錄結(jié)果。5.取三組小鼠的背部創(chuàng)面及其邊緣皮膚組織做組織學(xué)觀察。6.分別于24h、48h、72h取三組小鼠的創(chuàng)面皮膚組織、肝臟、脾臟,采用RT-PCR檢測(cè)上述組織中IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、TNF-α的mRNA表達(dá)量。7.分別于24h、48h、72h取三組小鼠的外周血、創(chuàng)面皮膚組織、脾臟、淋巴結(jié)(雙側(cè)腋下及雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)),制備單細(xì)胞懸液,采用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)上述組織中CD4~+T細(xì)胞、CD8~+T細(xì)胞、CD11c~+DCs、CD11c~+CD86~+DCs的比例。結(jié)果:1.燙傷感染組小鼠的一般狀況、自主活動(dòng)和對(duì)外界刺激的反應(yīng)較對(duì)照組和燙傷組明顯較差;體重持續(xù)明顯下降,在72h下降了約13%;死亡率高達(dá)60%~80%。其他兩組的一般狀況良好,體重穩(wěn)定,死亡率也未見異常。2.燙傷感染組表皮有大量壞死物附著,毛囊等皮膚附屬器基本壞死;真皮層膠原纖維排列紊亂,大量空泡形成;皮肌層肌纖維橫紋大量消失,細(xì)胞崩解壞死明顯,大量多形粒細(xì)胞浸潤(rùn)。3.燙傷感染組各臟器內(nèi)的細(xì)菌定量均明顯高于其他兩組,差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中脾臟的細(xì)菌含量最高,約為含量最低的心臟結(jié)果的10倍,對(duì)照組和燙傷組小鼠的臟器細(xì)菌定量水平較低。4.燙傷感染組小鼠的肝腎功能明顯下降,肝功能指標(biāo)ALT升高至對(duì)照組的3~4倍,AST為對(duì)照組的2~3倍,腎功能指標(biāo)BUN、Scr均升高至對(duì)照組的2~3倍。5.燙傷感染組小鼠組織中的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量均有顯著升高,其中IL-6、IL-12、TNF-α、IL-15的表達(dá)水平在48小時(shí)內(nèi)上升明顯,與對(duì)照組有顯著差異,IL-6在脾臟的表達(dá)水平為對(duì)照組的5倍,在皮膚的最高可達(dá)對(duì)照組的10倍。IL-10在創(chuàng)面組織和肝臟組織中的表達(dá)水平持續(xù)增加,約為對(duì)照組的2倍,在脾臟組織中的表達(dá)水平較為穩(wěn)定,約為對(duì)照組的3倍。6.在燙傷感染組小鼠外周血、脾臟和淋巴結(jié)中的的T細(xì)胞比例均出現(xiàn)明顯下降,CD4~+T細(xì)胞/CD8~+T細(xì)胞比值均有持續(xù)減小的表現(xiàn),在72h達(dá)到較低水平。燙傷組的T細(xì)胞比例介于其他兩組之間,CD4~+T細(xì)胞/CD8~+T細(xì)胞比值未見明顯變化。燙傷感染組的創(chuàng)面皮膚組織中T細(xì)胞的比例持續(xù)增加,顯著高于對(duì)照組,CD4~+T細(xì)胞/CD8~+T細(xì)胞比值在24h達(dá)到最大值,約為對(duì)照組的兩倍,在48h和72h持續(xù)降低,與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。燙傷組的T細(xì)胞持續(xù)升高,但均低于燙傷感染組,CD4~+T細(xì)胞/CD8~+T細(xì)胞比值無明顯變化。7.燙傷組和燙傷感染組的外周血中樹突狀細(xì)胞比例均持續(xù)下降,且燙傷感染組下降更加明顯,兩組與對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD86~+樹突狀細(xì)胞比例在24h和48h均高于對(duì)照組,48h高達(dá)30%,在72h降至20%。燙傷組和燙傷感染組創(chuàng)面皮膚中的樹突狀細(xì)胞的比例均持續(xù)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CD86+樹突狀細(xì)胞的比例變化規(guī)律與外周血一致,在48h達(dá)到最高,在72h降至較低水平。在燙傷感染組脾臟中的樹突狀細(xì)胞在24h和48h均高于對(duì)照組,72h降低與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,CD86~+樹突狀細(xì)胞的比例在24h最高,約為30%,在72h降至20%以下。燙傷感染組淋巴結(jié)中的樹突狀細(xì)胞比例均低于對(duì)照組,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而CD86~+樹突狀細(xì)胞的比例也在持續(xù)減小,在48h和72h均明顯低于燙傷組和對(duì)照組。結(jié)論:1、本實(shí)驗(yàn)建立的燒傷創(chuàng)面膿毒癥小鼠模型穩(wěn)定有效。2、燒傷創(chuàng)面膿毒癥小鼠早期創(chuàng)面炎癥反應(yīng)發(fā)展迅速包括細(xì)胞免疫和非特異性免疫反應(yīng),48h后出現(xiàn)細(xì)胞免疫減弱,樹突狀細(xì)胞分化障礙,促炎因子表達(dá)水平下降,而抗炎反應(yīng)持續(xù)增強(qiáng)。3、燒傷創(chuàng)面膿毒癥小鼠脾臟組織中的細(xì)胞免疫在在24h和48h較為穩(wěn)定,72h后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞免疫障礙,而樹突狀細(xì)胞的分化障礙在48h已經(jīng)出現(xiàn)。
【圖文】：

第 3 章 結(jié)果第 3 章 結(jié)果情況般情況組：小鼠毛發(fā)光亮，，活動(dòng)敏捷，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，飲食飲小鼠毛發(fā)光亮，活動(dòng)減少，對(duì)外界刺激的反應(yīng)正常，創(chuàng)面逐偶有少許暗紅色斑點(diǎn)分布，創(chuàng)面周圍無明顯腫脹，飲食飲水：小鼠毛發(fā)無光澤，活動(dòng)明顯減少，活動(dòng)的姿勢(shì)異常，呈蜷縮激反應(yīng)遲鈍，創(chuàng)面為暗紅色痂狀，創(chuàng)周皮膚腫脹，飲食飲水明重

三組小鼠的生存率結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2589334