【摘要】：研究目的明確Necrostatin-1對膿毒血癥AKI的保護作用,并探討其可能的保護機制。研究方法在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射建立的膿毒血癥AKI模型及LPS誘導HK-2細胞建立的膿毒血癥AKI腎小管上皮細胞損傷模型中,使用Nec-1干預,觀察Nec-1的腎臟保護作用以及對腎小管上皮細胞死亡、自噬以及線粒體損傷等的影響。結(jié)果腹腔注射LPS的小鼠血肌酐(LPS組30.08±4.18μmol/Lvs.對照組9.80±1.84μmol/L,p0.001)及尿素氮(LPS 組 32.54±5.46mmol/Lvs.對照組13.87±4.83mmmol/L,p0.001)較對照組明顯升高。而使用Nec-1預處理,則可逆轉(zhuǎn)血肌酐(LPS+Nec-1 組 11.50±1.67μmol/Lvs.LPS 組 30.08±4.18μmol/L,p0.001)及尿素氮(LPS+Nec-1 組 14.15±4.14mmol/L vs.LPS 組32.54±5.46mmol/L,p0.001)的升高,提示Nec-1對膿毒血癥小鼠具有腎臟保護性作用。LPS干預組小鼠腎臟組織p-RIP-3及p-MLKL蛋白水平均明顯升高。而Nec-1可抑制升高的p-RIP-3和p-MLKL的水平。HK-2細胞模型中也同樣看到類似變化。三組小鼠的腎臟病理中,均未見到明顯腎小管上皮細胞壞死。在HK-2細胞模型中,采用Annexing V/PI染色后流式細胞檢測的方法發(fā)現(xiàn)照組、LPS干預組以及Nec-1預處理+LPS干預組間細胞壞死數(shù)量未見到明顯差異。提示Nec-1對腎臟保護并不通過抑制necroptosis作用。LPS干預小鼠腎臟自噬體標志物LC3-Ⅱ和自噬底物p62蛋白均明顯升高。同時電鏡觀察發(fā)現(xiàn),雖然LPS組小鼠腎小管上皮細胞自噬體較對照組明顯增加,而卻未見明顯自噬溶酶體。提示LPS組小鼠存在自噬清除受損。當對LPS小鼠使用Nec-1預處理后,LC3-Ⅱ和p62蛋白水平明顯回落,電鏡中也出現(xiàn)大量的自噬溶酶體。提示Nec-1促進了膿毒血癥AKI小鼠腎小管上皮細胞的自噬清除。在LPS干預的HK-2細胞中同樣看到LC3-Ⅱ及p62蛋白水平升高,而Nec-1預處理可抑制LC3-Ⅱ及p62蛋白水平。電鏡觀察到LPS組小鼠腎小管上皮細胞線粒體數(shù)目減少,同時伴有線粒體腫脹、空泡化以及線粒體嵴的消失。而Nec-1預處理小鼠則線粒體損傷明顯減輕。在HK-2細胞模型中使用Mitotracker對線粒體進行染色,也發(fā)現(xiàn)LPS可引起線粒體片段化以及數(shù)目減少,而Nec-1則可減輕線粒體損傷。LPS組小鼠腎組織介導線粒體分裂的蛋白p-DRP1 水平明顯升高,控制線粒體功能及再生的PGC1-α轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平明顯減低,而Nec-1可以減少p-DRP1,升高PGC1-α轉(zhuǎn)錄及表達。結(jié)論在本研究中,Nec-1可以減輕膿毒血癥AKI小鼠的腎臟損傷。但是并非經(jīng)由減少necroptosis的這一途徑,而是通過了以下兩方面發(fā)揮腎臟保護作用:1、Nec-1可以逆轉(zhuǎn)膿毒血癥AKI時腎小管上皮細胞自噬清除障礙;2、Nec-1通過阻止RIP-3磷酸化p-DRP1以及上調(diào)PGC1-α的轉(zhuǎn)錄從而減輕腎小管上皮細胞線粒體損傷。
【圖文】：

圖１：腹腔注射ＬＰＳ小鼠腎功能較對照組明顯升高，，而腹腔注射注射Ｎｅｃ－１可以改善ＬＰＳ逡逑誘導的功能下降

碩士學位論文逡逑檢測ＨＫ－２細胞各組ｐ－ＲＩＰ－３和ｐ－ＭＬＫＬ蛋白；Ｅ＆Ｆ：邋ＨＫ－２細胞各組ｐ－ＲＩＰ－３和ｐ－ＭＬＫＬ逡逑蛋白ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ灰度分析。ＬＰＳ：脂多糖；Ｎｅｃ－１：邋ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－１；邋ｐ－ＲＩＰ－３：枺酸化受體相逡逑關(guān)蛋白－３；邋ｐ－ＭＬＫＬ：磷酸化混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域。＊ｐ＜邋０．０５。逡逑三、Ｎｅｃ－１對膿毒血癥ＡＫＩ時腎小管上皮細胞死亡的作用逡逑三組小鼠的腎臟病理ＰＡＳ染色均未見明顯腎小管上皮細胞壞死，僅在ＬＰＳ逡逑組可見局灶的腎小管上皮細胞空泡變性。提示Ｎｅｃ－１對腎臟保護性作用并非經(jīng)逡逑由對ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ的抑制。逡逑
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R459.7;R692

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