【摘要】：為了適應臨床病原微生物檢測需求,保障國家公共衛(wèi)生安全,提高人民健康水平,建立能對病原微生物特征信息進行快速、多靶點檢測且適用于自動化平臺的分子診斷新技術十分必要,具有非常重要的實用價值和社會意義。致瀉性大腸埃希氏菌在腹瀉菌中占有很大比例,主要是通過污染的食物和水傳播,我國檢出率較高的地區(qū)主要在山東、福建、河南。傳統(tǒng)的檢測方法主要是以培養(yǎng)為基礎的形態(tài)學檢測和生化檢測,這種方法操作繁瑣、檢測時間長,難以滿足臨床檢測要求。隨著分子生物學的發(fā)展,以核酸為基礎的檢測方法越來越多的應用到病原微生物的檢測,但大多方法普遍難以實現(xiàn)高通量自動化檢測。本研究旨在結(jié)合多重PCR和編碼磁性微粒的優(yōu)勢,以大腸埃希氏菌(E.coli)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(enteroinvasive E.colic,EIEC)、腸致病性大腸埃希氏菌(enteropathogenic E.colic,EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌(enterotoxigenic E.coli,ETEC)、出血性大腸埃希氏菌(enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)為檢測靶標,建立了一種新型、快速、高通量且易于實現(xiàn)自動化檢測的方法,從而能夠快速、準確、高效地檢測病原微生物。本研究的主要內(nèi)容包括以下幾個方面:第一,多重PCR反應體系的構(gòu)建。以腸侵襲性大腸埃希氏菌、腸致病性大腸埃希氏菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌為檢測目標設計了8對特異性引物和一對通用引物。對多重PCR中第一步PCR中的第一階段,即基因特異性引物擴增階段的循環(huán)數(shù)進行了優(yōu)化,確定12循環(huán)效果更好。調(diào)試了特異性擴增階段混合引物中各引物的工作濃度,最后確定uid A、ipaH、stx2、stx1、eae、rfbe、ST、LT的最佳工作濃度分別為0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM、0.8μM。第二,多重PCR結(jié)合基因芯片檢測方法的研究。針對4種致瀉性大腸埃希氏菌的靶基因設計了對應的捕獲探針序列、對照探針序列以及陽性對照組的互補序列。通過多重PCR和基因芯片技術聯(lián)用,建立了基因芯片檢測方法。確定了EHEC、ETEC、EPEC、EIEC、E.coli的檢測靈敏度分別為1.3×104 CFU/mL、2×105 CFU/mL、4×104 CFU/mL、7.2×104 CFU/mL、1.7 CFU/mL。第三,用構(gòu)建的多重PCR結(jié)合編碼磁性微粒芯片的檢測方法研究。應用編碼磁性微粒芯片檢測5種大腸埃希氏菌,檢測特異性好,EHEC、ETEC、EPEC、EIEC、E.coli的檢測靈敏度可達1.3×104 CFU/mL、2×104 CFU/mL、4×104 CFU/mL、7.2×104 CFU/mL、1.7 CFU/mL。編碼磁性微粒芯片的單個菌株檢測結(jié)果與基因芯片結(jié)果相近,但對于菌株中的單個靶分子,大多數(shù)編碼磁性微粒芯片的檢測靈敏度更高。
【圖文】：

碩士畢業(yè)論文碼磁性微粒及其在生物檢測中的應用碼磁性微粒的特點碼磁性顆粒(Barcoded Magnetic Beads, BMBs) 是由 Winston Ho 等在 2012 年 4 月正式發(fā)布成為商品，屬于美國 AppliedBioCode 公司分別為 70-100 μm、25 μm、6 μm；由順磁性生物相容高分子復合組裝構(gòu)成，不僅生物相容性好而且分子長期穩(wěn)定，易于磁分離；工藝，，條形碼制備成本低，且條碼易被準確掃描，共有 4096 個可用 4095，從而可以同時檢測 4096 個不同的靶分子，實現(xiàn)高通量檢發(fā)了 BMB 分析系統(tǒng)：BioCode MD×3000（見圖 1-1）、BioCodee1000A 可以實現(xiàn)高通量檢測。

圖 1-2 編碼磁性微粒工作原理示意圖(a) 基于核酸雜交的檢測原理；(b) 基于抗原抗體結(jié)合的檢測原理基于 BMB 的檢測方法易實現(xiàn)高通量檢測、信號穩(wěn)定、檢測設備簡單且能夠?qū)崿F(xiàn)自動化檢測。近年來 BMB 受到了廣泛的關注，Zhang 等[60]用編碼磁性微粒技術檢測出了人血清中的 30 個細胞因子，檢出限小于 5 pg/mL，細胞因子間和同一細胞因子內(nèi) CV 均小于 10%，與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果有很好的相關性。Casen等[61]采用編碼磁性微粒技術檢測腸道菌群，針對 300 種細菌設計了 54個探針，通過與 165 例健康者細菌普相比，發(fā)現(xiàn) 73%的腸易激綜合征(IrritableBowel Syndrome, IBS) 腸道菌群微生態(tài)失調(diào)，且深度測序與實驗結(jié)果高度相關。除此之外，據(jù)一些會議海報和新聞報道也有一些科研團隊開始使用編碼磁性微粒技術來進行各種研究，如 AppliedBioCode 公司從 2014 年一直致力于腸道微生物的檢測，2016 年用高通量 BioCode MD×3000 系統(tǒng)同時檢測 18 種腸道微生物，檢測限為 102至 105CFU/mL。臺灣 Sandra Lee 等人用編碼磁性微粒技術實現(xiàn)了HPV(Human Papillomavirus) 的 50 種分型。Cheryl Sesler 等人用這種技術結(jié)合
【學位授予單位】：湖南工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R446.5

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 廖佩;陳慧;鄔燕琪;方壹樂;陳柱;鄧燕;何農(nóng)躍;;基于封閉式卡盒的現(xiàn)場病原體檢測系統(tǒng)的設計與實現(xiàn)[J];南京醫(yī)科大學學報(自然科學版);2017年02期

2 鄔旭龍;肖璐;姜睿姣;王印;楊澤曉;姚學萍;張鵬飛;張博;;靶序列富集多重PCR技術的發(fā)展及其應用[J];湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版);2016年02期

3 趙嘉詠;朱敏;謝志強;黃麗莉;穆玉姣;夏勝利;冉陸;;河南省5種致瀉性大腸埃希菌病原學監(jiān)測[J];中國病原生物學雜志;2015年10期

4 王乃福;吳冬雪;張霞;劉培;張海英;高旗利;;致瀉性大腸桿菌基因芯片檢測方法的建立[J];食品研究與開發(fā);2014年07期

5 楊勁松;李玉燕;廖慧;林杰;羅朝晨;陳愛平;;2010～2012年福建省致瀉性大腸桿菌監(jiān)測結(jié)果分析[J];預防醫(yī)學論壇;2014年03期

6 張承玲;王文;徐文杰;;1995～2010年滕州市腹瀉病人致瀉性大腸桿菌檢測結(jié)果分析[J];預防醫(yī)學論壇;2011年08期

7 A.Trusov;R.Bumgarner;R.Valijev;R.Chestnova;S.Talevski;C.Vragoterova;E.S.Neeley;尚美;劉宇紅;;Lumin~(TM)光二極管熒光裝置、熒光顯微鏡、萋-尼法診斷抗酸桿菌的比較[J];國際結(jié)核病與肺部疾病雜志(中文版);2009年03期

8 韓衛(wèi)寧;韓健;;分子鑒別診斷領域的革命性技術——Tem-PCR[J];細胞與分子免疫學雜志;2009年02期

9 王培英,金文華;上海市南匯區(qū)現(xiàn)行防病體系應對突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的缺陷和對策[J];上海預防醫(yī)學雜志;2004年10期

10 程伯鯤;致瀉性大腸埃希氏菌的毒力因子[J];中國人獸共患病雜志;1998年05期

相關碩士學位論文 前1條

1 趙紅慶;五種致腹瀉大腸埃希菌的多重PCR檢測研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2007年

本文編號：2559738