本文關鍵詞： CTX-M-55 分布特征 分子進化 抗藥活性　出處：《鄭州大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景與目的CTX-M-55型ESBL,最初于2005在泰國被發(fā)現(xiàn)報道,與CTX-M-3型ESBL相比較,其有兩個氨基酸位點突變,即在第77位的纈氨酸取代原來的丙氨酸,第240位的甘氨酸取代天冬氨酸。不同國家不同地域,CTX-M-55型ESBL的分布流行情況不同。同一國家的不同地區(qū),CTX-M-55的分布流行情況也存在差異。目前,河南地區(qū)CTX-M-55型ESBL的流行分布情況尚不明確。在本課題組前期進行的CTX-M型分子進化研究中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在肺炎克雷伯菌中存在頭孢噻肟酶的一條進化路徑,即CTX-M-3→CTX-M-15→CTX-M-55。但由于編碼CTX-M型ESBL的耐藥基因可以在不同菌種間通過質(zhì)粒水平傳播,目前河南地區(qū)與CTX-M-55型ESBL相關酶型是否存在其他的進化路徑及進化節(jié)點,仍需要進一步的分析研究。本課題組通過檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合子的抗藥活性來間接反映CTX-M型ESBL的抗藥活性。但是由于攜帶bla CTX-M-55耐藥基因的質(zhì)粒往往攜帶有其他耐藥基因,該種方法并不能客觀評價單一CTX-M-55型ESBL的抗藥活性。為解決以上問題,我們設計了該課題。旨在通過臨床標本分離菌的統(tǒng)計分析及相關分子生物學檢測,探明河南地區(qū)CTX-M-55型ESBL的分布特征;通過構(gòu)建分子進化樹,明確與CTX-M-55型ESBL相關的進化路徑和進化節(jié)點;通過構(gòu)建CTX-M-55轉(zhuǎn)化子,客觀評價CTX-M-55型ESBL抗藥活性,最終為臨床抗攜帶CTX-M-55型ESBL菌株感染治療提供實驗室指導。第一部分:CTX-M-55型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的分布及進化研究方法(1)菌株收集及藥敏實驗收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科微生物實驗室2015年9月份至2016年6月份三代頭孢菌素耐藥的革蘭陰性桿菌300株。藥敏試驗根據(jù)CLSI 2015判斷結(jié)果(2)ESBL表型確證實驗按CLSI推薦方法進行ESBL表型確證實驗(3)普通PCR初篩產(chǎn)blaCTX-M-55-like菌株(4)blaCTX-M-55-like耐藥基因的全長序列擴增及測序。(5)ERIC1-PCR檢測菌株同源性(6)普通PCR檢測其他ESBL編碼基因(7)進化分析采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,采用NETWORK軟件進行進化節(jié)點分析。結(jié)果1.CTX-M型ESBL在革蘭陰性菌中的分布情況23%的革蘭陰性菌為產(chǎn)CTX-M型ESBL菌株,依次為CTX-M-3(42.1%),CTX-M-15(33.4%),CTX-M-55(20.3%),CTX-M-64(n=1.4%),CTX-M-136(1.4%)和CTX-M-187(1.4%)。2.產(chǎn)CTX-M-55型ESBL菌株的臨床分布流行特征及耐藥表型產(chǎn)CTX-M-55型ESBL菌株主要為大腸埃希菌,主要分布在外科科室,主要分離于血液標本。藥敏結(jié)果顯示該類菌株對頭孢噻肟與頭孢他啶的耐藥率極高,均為92.86%。對哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星有較好的敏感性。3.CTX-M-55型ESBL在各菌種間的分布情況CTX-M-55型ESBL主要分布于大腸埃希菌(9/14),肺炎克雷伯菌(3/14),弗氏檸檬酸桿菌(1/14)和摩根摩根菌(1/14)。ERIC結(jié)果顯示各菌株均不同源。4.河南地區(qū)blaCTX-M-55耐藥基因相關進化路徑及進化節(jié)點分析在大腸埃希菌中存在頭孢噻肟酶的新進化節(jié)點即CTX-M-136。第二部分CTX-M-55型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的抗藥活性研究方法(1)構(gòu)建p UCm-T-CTX-M-55克隆載體(2)構(gòu)建p ET-30a(+)-CTX-M-55表達載體(3)CTX-M-55型ESBL的誘導表達采用SDS-PAGE電泳與考馬斯亮藍染色檢測CTX-M-55型ESBL融合蛋白表達情況。(4)CTX-M-55轉(zhuǎn)化子抗藥活性檢測采用VetekⅡ全自動微生物鑒定及藥敏檢測系統(tǒng)檢測CTX-M-55轉(zhuǎn)化子活性,以2015年CLSI為結(jié)果判斷標準。結(jié)果1.成功構(gòu)建p UCm-T-CTX-M-55克隆載體。2.成功構(gòu)建p ET-30a(+)-CTX-M-55表達載體。3.CTX-M-55型ESBL融合蛋白主要為上清表達。4.上清表達最佳誘導條件:IPTG 0.5m M,溫度11℃,過夜誘導。5.CTX-M-55轉(zhuǎn)化子對青霉素、頭孢菌素一代、三代及四代中多數(shù)藥物耐藥,且對頭孢噻肟的水解活性強于頭孢他啶。對氨基糖胺類、氟奎諾酮類和碳青霉烯類、加酶抑制劑類表現(xiàn)敏感。結(jié)論1.河南地區(qū)大腸埃希菌是CTX-M-55型ESBL主要攜帶菌株。2.河南地區(qū)首次檢出CTX-M-136型ESBL和CTX-M-187型ESBL,其中CTX-M-187型ESBL為世界首次報道。3.在大腸埃希菌中存在頭孢噻肟酶的新進化節(jié)點:CTX-M-136。4.CTX-M-55轉(zhuǎn)化子具有產(chǎn)ESBL菌株的抗藥活性。
[Abstract]:The distribution and evolution of CTX - M - 55 ESBL in Henan Province were investigated by means of statistical analysis and molecular biological detection of CTX - M - 55 ESBL . ( 4 ) CTX - M - 55 type ESBL was used to detect CTX - M - 55 expression vector . Results 1 . CTX - M - 55 type ESBL was successfully constructed .

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R446.5

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本文編號：1452133