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2002年29(3)微生物學(xué)通報?75?專論與綜；生物表面活性劑對微生物生長和代謝的影響；錢欣平1陽永榮孟琴；(浙江大學(xué)聯(lián)合化學(xué)反應(yīng)工程研究所杭州310027；摘要:綜述了生物表面活性劑在微生物生長和代謝過程；系統(tǒng)分析了生物表面活性劑通過與難溶底物和微生物細(xì)；機理,利用該機理可以合理解釋生理現(xiàn)象；中發(fā)揮特殊功能；關(guān)鍵詞:生物表面活性劑,糖脂,鼠李糖脂,烴類發(fā)

2002年29(3)　　　　　　　　　　　　微生物學(xué)通報?75?專論與綜述

生物表面活性劑對微生物生長和代謝的影響

錢欣平1　陽永榮　孟　琴

(浙江大學(xué)聯(lián)合化學(xué)反應(yīng)工程研究所　杭州　310027)

摘要:綜述了生物表面活性劑在微生物生長和代謝過程中的影響。根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)特征,

系統(tǒng)分析了生物表面活性劑通過與難溶底物和微生物細(xì)胞之間的相互作用促進烷烴攝取的

機理,利用該機理可以合理解釋生理現(xiàn)象。生物表面活性劑還在參與細(xì)胞代謝活動的過程

中發(fā)揮特殊功能。

關(guān)鍵詞:生物表面活性劑,糖脂,鼠李糖脂,烴類發(fā)酵

中圖分類號:Q93　　文獻標(biāo)識碼:A　　文章編號:025322654(2002)0320075204

生物表面活性劑是生物(主要是微生物)生成的低分子量表面活性劑,包括糖脂、多糖脂、脂肽、脂蛋白以及中性類脂衍生物等。它們的分子結(jié)構(gòu)由兩部分組成,一部分是疏油親水的極性基團,如單糖、聚糖、氨基酸、肽和磷酸基等,另一部分是由疏水親油的碳?xì)滏溄M成的非極性基團,如飽和或非飽和的脂肪醇及脂肪酸等。正是由于具有這種既親油又親水的兩親性分子結(jié)構(gòu),生物表面活性劑才能具有分散、加溶、潤濕、滲透等性能,但它們的生理功能還不是很清楚[1]。

雖然大多數(shù)的生物表面活性劑被看作是次級代謝產(chǎn)物,但它們對微生物的生長卻具有重要作用。例如,烴類的難溶性使得攝取烴類的微生物在生長過程中往往伴隨著生物表面活性劑的生成,它們的作用主要是使烴類在水溶液中有效擴散,并滲入細(xì)胞內(nèi)部被同化分解。另一方面,生物表面活性劑可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的疏水性能來影響微生物細(xì)胞與烴類之間的親和力。除此之外,很多生物表面活性劑具有殺菌活性,并在細(xì)菌滑動穿越界面的活動中以及適應(yīng)惡劣環(huán)境的代謝過程中發(fā)揮特殊作用。幾乎所有這些生物功能均與它們的兩親性分子特征相關(guān)。

1　促進難溶底物的分散與吸收

烴降解酶往往嵌入于細(xì)胞質(zhì)膜中或存在于細(xì)胞內(nèi),烴類底物必須通過外層親水細(xì)胞壁進入細(xì)胞內(nèi),才能被烴降解酶作用。因此,烴的疏水性是限制烴被攝取的主要因素,而生物表面活性劑的作用正是促使烴被動擴散進入細(xì)胞內(nèi)部。

生物表面活性劑促進烴吸收的作用在許多實驗中均得到證實[2]。例如,1,500mg/L的十八烷烴在300mg/L鼠李糖脂的作用下,擴散濃度提高了4個數(shù)量級,使20%的十八烷烴在84h內(nèi)被P.areuginosa降解,而在沒有鼠李糖脂存在的情況下,僅有5%的十八烷烴被利用。另外,P.areuginosa的一株缺陷型菌株無法利用石蠟進行生長,合成的鼠李糖脂明顯較少,但加入少量鼠李糖脂可以修復(fù)它利用石蠟的能力。

實驗發(fā)現(xiàn)[3],低濃度的鼠李糖脂促進十八烷烴擴散的能力明顯優(yōu)于高濃度的鼠李糖脂。研究鼠李糖脂濃度與十六烷烴生物降解速率的關(guān)系曲線,結(jié)果在1～50mg/L范

　收稿日期:2001201212,修回日期:2001203230

?76?微生物學(xué)通報　　　　　　　　　　　　2002年29(3)圍內(nèi)與50～500mg/L范圍內(nèi),呈現(xiàn)出兩種不同的線性關(guān)系,在較低的濃度范圍內(nèi),十八烷烴可以被更快地利用。分析認(rèn)為[4],生物表面活性劑可以通過兩種途徑來提高有機物的生物可利用率。一種途徑在較低濃度下,顯著降低界面張力,使烷烴得以有效擴散,增大油/水界面面積,從而便于細(xì)胞與較大油滴之間的直接接觸。另一種途徑是利用表面活性劑的增溶作用,即當(dāng)活性劑濃度大于臨界膠束濃度(CMC)時,自由單體濃度不再增加,而是形成膠團,將有機物分子加溶在膠團中,然后被細(xì)胞吸收并降解。表面活性劑的濃度進一步增加時,溶液的表面張力幾乎不再下降,而溶液中的膠團數(shù)目和尺寸卻隨之增加。表面活性劑的濃度越大,膠團形成得越多,難溶物也就溶解得越多。另外,微生物在烴類培養(yǎng)基中生長時,細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯不同[5]:胞內(nèi)發(fā)生烷烴的累積,在它們的外面有一層特殊的膜狀復(fù)合物;細(xì)胞的外表面變得不規(guī)整,出現(xiàn)褶皺。根據(jù)以上事實推測,在生物表面活性劑的作用下,細(xì)胞壁的外表面出現(xiàn)一種特殊的吸收系統(tǒng),將加溶了難溶底物的膠團直接運至與膜結(jié)合的酶系統(tǒng)或運入細(xì)胞內(nèi)部。

生物表面活性劑膠團加溶難溶有機物的現(xiàn)象十分復(fù)雜,在不同條件下可以形成多種膠團結(jié)構(gòu),膠團的大小與形狀主要取決于表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)與濃度[6]。疏水基碳原子數(shù)的增加將導(dǎo)致表面活性劑的親油性增加,在水溶液中的膠團尺寸相應(yīng)增加,CMC也下降。在活性劑濃度剛剛超過CMC時,膠團大多呈球狀,極性基處在膠團外殼與水直接接觸;當(dāng)活性劑在溶液中的濃度為10倍于CMC或更高時,從能量角度來講形成球狀是不利的,這時棒狀膠團具有更高的熱力學(xué)穩(wěn)定性;當(dāng)活性劑的濃度更高時,就會形成巨大的層狀膠團。另一方面,活性劑分子中親水頭部與疏水尾部的相對大小決定了膠團的形狀。頭部較大者易形成球狀,頭部較小、尾部較短者易形成棒狀,而具有較長尾部的活性劑往往形成膠囊狀膠團。

除了表面活性劑本身的性質(zhì)與濃度之外,溫度、無機鹽、離子強度以及pH等均可以對CMC和膠團性質(zhì)產(chǎn)生影響,進而影響烴類的分散及生物降解[7]。例如,pH通過影響溶液中表面活性劑的聚集形式來影響烴類的擴散。在pH710,烷烴被插入膠團粒子中,烷烴的擴散最充分;在pH710～610,表面活性劑形成層狀膠團,烷烴的擴散程度急劇下降;在pH610～515,表面活性劑形成膠囊狀膠團,烷烴的擴散程度再次提高。

微生物在生長過程中,往往生成多種結(jié)構(gòu)型式的表面活性劑,這可能是微生物適應(yīng)環(huán)境能力的表現(xiàn)[8]。由于環(huán)境對膠團的性質(zhì)會產(chǎn)生影響,微生物便通過調(diào)節(jié)多種活性劑的組成分布,來保證烷烴得到最大程度的分散。如鼠李糖脂具有脂肪酸型和甲酯型兩種存在形式:脂肪酸型的疏水端含有羰基基團,它攜帶的一個負(fù)電荷增強了鼠李糖脂和水的作用,減弱了和烷烴的作用,因此其水溶性很好,但在降低界面張力方面不是很有效;相反,甲酯型的疏水端多一個碳原子,形成膠團的尺寸較大,具有較低的CMC,可以產(chǎn)生更低的表面和界面張力。這樣微生物就可以通過調(diào)節(jié)脂肪酸型和甲酯型兩種形式鼠李糖脂的濃度,兼顧水溶性和親油性兩個矛盾,最大程度地適應(yīng)各種不同環(huán)境。

2　調(diào)節(jié)細(xì)胞表面與難溶底物之間的親和力

一些菌種合成的生物表面活性劑對其它菌種在烴類培養(yǎng)基中的生長沒有影響甚至產(chǎn)生抑制作用;烷烴的生物降解不僅取決于生物表面活性劑的性質(zhì)與用量,還與細(xì)胞的性質(zhì)和濃度密切有關(guān);理想的分散狀況并不總是對應(yīng)著較高的生物降解速率[9]。這

2002年29(3)　　　　　　　　　　　　微生物學(xué)通報?77?些說明生物表面活性劑在微生物攝取烴類的過程中,不僅僅具有分散烴類的能力,還應(yīng)該從細(xì)胞、生物表面活性劑、烴三個方面來分析。

油滴與細(xì)胞的直接接觸常常是主要的烴吸收機制,而細(xì)胞表面的疏水性是決定細(xì)胞與烴類液滴接觸的關(guān)鍵性質(zhì)。烷烴的快速降解者具有較高的細(xì)胞疏水性,對烴類具有更高的親和性,可以更加有效地利用烴類。而生物表面活性劑可以提高慢速降解者的細(xì)胞疏水性,并直接影響生物降解速率。

生物表面活性劑分子可以利用它們的親水基或疏水基錨定于微生物細(xì)胞表面,將另一端暴露在外面,形成控制細(xì)胞表面疏水性或親水性的調(diào)節(jié)膜。微生物也可以分泌生物表面活性劑于外部介質(zhì)中,通過改變吸附界面的特性來調(diào)節(jié)細(xì)胞與界面之間的親和力。如將疏水界面轉(zhuǎn)換為親水性質(zhì),使其只能與親水細(xì)胞發(fā)生相互作用。吸附于界面上的微生物能夠通過釋放細(xì)胞表面的全部或部分表面活性劑來實現(xiàn)脫附,這些表面活性劑將被留在界面上或介質(zhì)中[10]。

3　其它生理功能

生物表面活性劑并不一定要在難溶性烷烴誘導(dǎo)作用下才能合成[2]。例如:Bacillussubtilis只能利用水溶性基質(zhì)產(chǎn)生生物表面活性劑;而T1apicola產(chǎn)生的糖脂沒有刺激菌種在烴類基質(zhì)中生長的能力;不能利用十六烷烴生長的缺陷型菌株,當(dāng)在葡萄糖培養(yǎng)基中生長時,卻可以產(chǎn)生兩倍數(shù)量的鼠李糖脂,而乳化作用在這一培養(yǎng)過程中顯然是不必要的。這些現(xiàn)象意味著生物表面活性劑除了可以促進難溶底物的攝取,還有其它生理功能。

生物表面活性劑往往具有抗菌活性。如Itoh實驗室分離得到的鼠李糖脂具有一定的抗菌、抗病毒和抗枝原體的性能[11]。這可能仍與它們的兩親性分子特征直接相關(guān)。即利用生物表面活性劑溶解異源細(xì)胞膜的主要成分來實現(xiàn)殺菌功能,或者通過改變環(huán)境的界面性質(zhì),使環(huán)境更有利于自身的生存。

生物表面活性劑的過量合成往往需要培養(yǎng)基中含有大量的碳源,以及一些限制性條件,如限制性氮源、限制性Mg2+等[12]。從代謝的角度分析,培養(yǎng)基中碳比氮多時,細(xì)胞生長將持續(xù)到氮源耗盡。當(dāng)細(xì)胞不再生長,需氮的生物合成反應(yīng)亦不再進行時,碳仍可運入細(xì)胞,在細(xì)胞中經(jīng)糖解或烴氧化,發(fā)生脂肪酸的累積。但當(dāng)胞內(nèi)脂肪酸濃度大于某一極限量時,細(xì)胞就不再能忍受其毒性。因此,脂肪酸與糖苷、氨基酸、磷酸基等結(jié)合,從而生成了各種生物表面活性劑。也就是說,生物表面活性劑是微生物調(diào)節(jié)自身代謝過程的一種產(chǎn)物。

以石蠟等烴類作為發(fā)酵基質(zhì)的微生物在限制性生長條件下和代謝轉(zhuǎn)換過程中,生物表面活性劑常常作為碳源和能量的儲備物質(zhì)發(fā)生累積,當(dāng)細(xì)胞處于極度饑餓狀態(tài)時,它們又會被氧化分解[13]。這類物質(zhì)包括海藻糖脂、脂肽、脂肪酸等。而且微生物不能利用鼠李糖脂進行生長,但是它在生長后期也會發(fā)生降解,具體原因還不清楚。

另一方面,生物表面活性劑對微生物的生長并不總是有利的。在中性環(huán)境中,低濃度的陰離子型表面活性劑與烴結(jié)合形成的復(fù)合物帶有負(fù)電,它與帶負(fù)電的細(xì)胞壁產(chǎn)生靜電排斥,從而強烈抑制細(xì)胞與烴的親和,反而抑制了細(xì)菌的生長[8]。另外,細(xì)胞與生物表面活性劑分子長期接觸,不僅會對膜結(jié)構(gòu)造成一定的破壞,還將引起膜活性的改變,干擾正常的攝取同化機制。

?78?微生物學(xué)通報　　　　　　　　　　　　2002年29(3)借助于代謝工程和基因工程的相關(guān)知識,確定具體的生物合成路徑將有助于了解生物表面活性劑的生理功能。生物表面活性劑中脂肪酸部分的合成單體或者是乙酰CoA或者是烴的氧化中間體,乙酰CoA是關(guān)鍵的合成中間體。在研究鼠李糖脂合成的相關(guān)基因時,利用分子克隆及核苷酸序列分析技術(shù),首先選育出鼠李糖脂合成的缺陷型菌株,分離得到鼠李糖脂生物合成的相關(guān)基因,然后將其與野生型菌株的基因?qū)嵭谢蚧パa。分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)鼠李糖脂的合成單體(TDP-鼠李糖和相應(yīng)的脂肪酸)在細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)存在時,鼠李糖脂的最終合成將被鼠李糖苷轉(zhuǎn)移酶所催化。這類酶共有兩種,負(fù)責(zé)催化四種鼠李糖脂的生成。而鼠李糖苷轉(zhuǎn)移酶由rhlAB基因編碼,與rhlAB基因位于同一個操縱子上的rhlR基因和rhlI基因順序排列,負(fù)責(zé)調(diào)控rhlAB基因的表達(dá)。RhlR調(diào)控蛋白的活性受細(xì)胞密度以及由RhlI蛋白形成的一種自誘導(dǎo)劑的影響。rhlI基因缺陷的變異菌株不能合成鼠李糖脂[14]。

目前,關(guān)于生物表面活性劑合成的分子生物學(xué)研究只是處于初期階段,進一步的遺傳學(xué)和酶學(xué)研究將有助于詳細(xì)了解它們生物合成的調(diào)控機理,從而最終確定它們的生理功能。

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真空冷凍干燥微生物的研究進展

李　華　駱艷娥　劉延琳

(西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院　楊陵　712100)

摘要:真空冷凍干燥法是保藏微生物的最有效的方法之一,為提高真空冷凍干燥后微生物細(xì)胞的成活率人們已進行了大量的研究。綜述了真空冷凍干燥方法的原理、應(yīng)用及提高真空冷凍干燥后微生物細(xì)胞成活率的方法。

關(guān)鍵詞:真空冷凍干燥,微生物

中圖分類號:Q939　　文獻標(biāo)識碼:A　　文章編號:025322654(2002)0320078204

　收稿日期:2001202228,修回日期:2001208215

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