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  本文關(guān)鍵詞：綠豆幼苗發(fā)育初期葉綠素生物合成的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2011年

豌豆鎂離子螯合酶Ⅰ亞基與硫氧還蛋白f的功能研究

余靜  

【摘要】：鎂離子螯合酶是葉綠素生物合成途徑(鎂分支)中的第一個酶,它催化鎂離子螯合到原卟啉IX中形成鎂原卟啉IX,對葉綠素的生物合成起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用。鎂離子螯合酶由三個亞基組成,分別為I亞基,D亞基和H亞基。這些亞基除了相互作用形成鎂離子螯合酶復(fù)合物行使功能以外,還參與其他的代謝途徑；同時也存在一些輔助蛋白與這些亞基相互作用,從而來影響鎂離子螯合酶的活性,繼而控制葉綠素的合成。鎂離子螯合酶的一個重要的輔助蛋白是GUN4蛋白,它與H亞基相互作用,并且可以結(jié)合鎂離子螯合酶的底物,從而促進鎂離子螯合酶的活性。最近日本一個研究小組發(fā)現(xiàn),在擬蘭芥中,硫氧還蛋白可以調(diào)控鎂離子螯合酶I亞基的氧化還原狀態(tài),從而影響其ATP酶活性。 為了利用豌豆體系在葉綠體研究中的便利研究硫氧還蛋白對鎂離子螯合酶I亞基的調(diào)控作用,首先,我們將NCBI數(shù)據(jù)庫中I亞基已有序列進行氨基酸序列比對,選擇完全同源的氨基酸序列設(shè)計兼并引物,用PCR得到豌豆中一段I亞基的cDNA序列,根據(jù)此cDNA設(shè)計基因特異性引物,用PCR的方法篩選豌豆葉片λgt11全長cDNA文庫并通過5'RACE的方法,得到豌豆I亞基基因的全長cDNA,該cDNA長度為1452bp,具有一個1266bp的完整開放閱讀框,可編碼422個氨基酸,該蛋白理論分子質(zhì)量約為45.98 KD,等電點約為5.43。然后,通過在大腸桿菌中表達外源重組的豌豆鎂離子螯合酶I亞基和硫氧還蛋白f,經(jīng)過鎳離子親和層析,我們獲得了I亞基和硫氧還蛋白f外源重組蛋白。體外生化實驗結(jié)果表明,豌豆硫氧還蛋白f能夠還原鎂離子螯合酶I亞基使其處于還原狀態(tài),從而激活I(lǐng)亞基的ATP酶活性和鎂離子螯合酶活性。 為進一步研究硫氧還蛋白f對鎂離子螯合酶的調(diào)控機理,我們利用酵母點對點實驗研究硫氧還蛋白f與鎂離子螯合酶各個亞基以及GUN4蛋白的相互作用情況,結(jié)果表明在酵母中硫氧還蛋白f只與I亞基有相互作用,與其它亞基和GUN4蛋白沒有相互作用。最后,我們利用病毒介導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing)技術(shù),分別獲得I亞基和硫氧還蛋白f基因沉默的豌豆植株。I亞基基因沉默植株中的葉片,莖,花萼和種皮都出現(xiàn)黃化的表型,葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量下降以及鎂離子螯合酶活性幾乎檢測不到,硫氧還蛋白f基因RNA水平表達量下降。但是硫氧還蛋白f基因沉默植株沒有明顯表型,葉綠素和類胡蘿卜素含量以及鎂離子螯合酶活性都不變,而且I亞基基因RNA水平表達量不變。所有的這些實驗結(jié)果,都將加深我們對硫氧還蛋白f和I亞基的了解。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：Q946
【目錄】：

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【參考文獻】

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