本文關(guān)鍵詞：綠豆幼苗發(fā)育初期葉綠素生物合成的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2011年

豌豆鎂離子螯合酶Ⅰ亞基與硫氧還蛋白f的功能研究

余靜  

【摘要】：鎂離子螯合酶是葉綠素生物合成途徑(鎂分支)中的第一個(gè)酶,它催化鎂離子螯合到原卟啉IX中形成鎂原卟啉IX,對(duì)葉綠素的生物合成起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用。鎂離子螯合酶由三個(gè)亞基組成,分別為I亞基,D亞基和H亞基。這些亞基除了相互作用形成鎂離子螯合酶復(fù)合物行使功能以外,還參與其他的代謝途徑；同時(shí)也存在一些輔助蛋白與這些亞基相互作用,從而來(lái)影響鎂離子螯合酶的活性,繼而控制葉綠素的合成。鎂離子螯合酶的一個(gè)重要的輔助蛋白是GUN4蛋白,它與H亞基相互作用,并且可以結(jié)合鎂離子螯合酶的底物,從而促進(jìn)鎂離子螯合酶的活性。最近日本一個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn),在擬蘭芥中,硫氧還蛋白可以調(diào)控鎂離子螯合酶I亞基的氧化還原狀態(tài),從而影響其ATP酶活性。 為了利用豌豆體系在葉綠體研究中的便利研究硫氧還蛋白對(duì)鎂離子螯合酶I亞基的調(diào)控作用,首先,我們將NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中I亞基已有序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),選擇完全同源的氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物,用PCR得到豌豆中一段I亞基的cDNA序列,根據(jù)此cDNA設(shè)計(jì)基因特異性引物,用PCR的方法篩選豌豆葉片λgt11全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)并通過(guò)5'RACE的方法,得到豌豆I亞基基因的全長(zhǎng)cDNA,該cDNA長(zhǎng)度為1452bp,具有一個(gè)1266bp的完整開(kāi)放閱讀框,可編碼422個(gè)氨基酸,該蛋白理論分子質(zhì)量約為45.98 KD,等電點(diǎn)約為5.43。然后,通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)外源重組的豌豆鎂離子螯合酶I亞基和硫氧還蛋白f,經(jīng)過(guò)鎳離子親和層析,我們獲得了I亞基和硫氧還蛋白f外源重組蛋白。體外生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,豌豆硫氧還蛋白f能夠還原鎂離子螯合酶I亞基使其處于還原狀態(tài),從而激活I(lǐng)亞基的ATP酶活性和鎂離子螯合酶活性。 為進(jìn)一步研究硫氧還蛋白f對(duì)鎂離子螯合酶的調(diào)控機(jī)理,我們利用酵母點(diǎn)對(duì)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)研究硫氧還蛋白f與鎂離子螯合酶各個(gè)亞基以及GUN4蛋白的相互作用情況,結(jié)果表明在酵母中硫氧還蛋白f只與I亞基有相互作用,與其它亞基和GUN4蛋白沒(méi)有相互作用。最后,我們利用病毒介導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing)技術(shù),分別獲得I亞基和硫氧還蛋白f基因沉默的豌豆植株。I亞基基因沉默植株中的葉片,莖,花萼和種皮都出現(xiàn)黃化的表型,葉片中葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量下降以及鎂離子螯合酶活性幾乎檢測(cè)不到,硫氧還蛋白f基因RNA水平表達(dá)量下降。但是硫氧還蛋白f基因沉默植株沒(méi)有明顯表型,葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量以及鎂離子螯合酶活性都不變,而且I亞基基因RNA水平表達(dá)量不變。所有的這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果,都將加深我們對(duì)硫氧還蛋白f和I亞基的了解。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：Q946
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