本文關(guān)鍵詞：不同培養(yǎng)條件對口腔細菌生物膜生長的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志2006 年 6 月第 22 卷第 6 期

J Clin St omatol, Jun, 2006, V ol. 22, N o. 6

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基礎(chǔ)研究

不同培養(yǎng)條件對口腔細菌生物膜生長的影響*
趙 今 * * * , 朱 日丙, 李繼遙, 周學(xué)東 * * , 肖曉蓉

( 四川大學(xué)口腔生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室 四川 成都
[ 摘要]

610041)

目的: 研 究 5 種口 腔細菌在體外形成生物膜的能力、 形成過程及 不同培養(yǎng) 條件對生物 膜形成的影 響,

并通過激光共聚焦掃描顯微鏡( CL SM ) 觀察細 菌生物 膜的形 成及結(jié) 構(gòu)特征。方 法: 選擇與 齲病發(fā)生 關(guān)系密 切的 5 種口腔細菌, 分別接種在含牛心腦浸液培養(yǎng)基( BHI ) 、 人工唾液( BM 5) 以及人唾液培 養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板中, 在培養(yǎng) 6 h、 h、 h、 h、 h、 h 和 60 h 后取出相應(yīng) 的微孔板, 11% Cryst al V iolet 染色 生物膜, 95% 乙 醇復(fù)吸 Cr ystal 8 12 24 36 48 V iolet, HT S7000PL U S 多孔板高效分析儀測定各 時段細 菌生物 膜的生長 情況, 并繪 制生 長曲線。 CL SM 觀察 細菌 生物膜形成的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果: 在 BHI 及 BM 5 中 5 種口腔細菌均能形成生物膜, 在人唾液中 沒有形成 生物膜。細 菌生物膜形成表現(xiàn)為緩慢的非線性生長, 出現(xiàn)了一個相對的生長停滯期, 這個時期出現(xiàn)在 36~ 48 h 之間, 不同細菌 略有差別。激光共聚焦掃描顯微鏡( CL SM ) 觀察發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng) 6 h 后僅 有少量 細菌粘附 形成散 在微菌 落, 24 h 后出 現(xiàn)生物膜的基本結(jié)構(gòu), 48 h 形成成 熟的生物膜。結(jié)論: 研究發(fā) 現(xiàn)在體外 細菌形 成生物 膜的能 力與培 養(yǎng)基條 件密切 相關(guān), 細菌生物膜形成緩慢, 其間有一個相對生長停滯期 。細菌定 植, 粘附, 共集聚是生物膜形成的重要步驟。 [ 關(guān)鍵詞] 細菌生物膜; 培養(yǎng)條件; 微孔板; 激光共聚焦掃描顯微鏡 R780. 2 [ 文獻標(biāo)識碼] A [ 文章編號] 1003- 1634( 2006) 06- 0323- 03 [ 中圖分類號]

Study of five cariogenic bacteria biofilm formation in vitro Chengdu 610041, China

ZH A O Jin, ZH U Bing , LI Ji-y ao , ZH O U X ue -

dong, XI A O X iao ong . K ey Lab. Of Or al Biomedical Engineer ing of M inistry of Education, Sichuan University , -r [ Abstract] Objective: T his research was to standardize a polyv iny l chlor ide ( P VC) micro titer plate assay to compare the ability of 5 cariogenic bacteria to form biofilms and to explore its character istic, ultra structure, and influences by dif ferent medium. Method: A total of 5 car iogenic bacteria strains were grow n in three differ ent medium included BHI, BM 5 and saliva medium in P VC micro iter plate wells. Biofilm formation was indirectly assessed by staining w ith 1% cr ystal -t violet and measuring cr ystal violet absorbance, using distaining solution. T he biofilm growth curves of 5 laboratory strains were made. T he ultrastructures of bioilm were observed under Co focal Laser Scanning M icrosco pe ( CLSM ) . Result: 5 car iogenic bacteria strains formed biofilm structur e in BH I and BM 5 medium, but in saliva medium no biofilm were ob served. T he developmental step in bio film formation include initial attachment to a surface, the for matio n of micro colonies and an mature bio film structur e. Conclusion: T he ability of car iogenic bacteria to form biofilm was influenced by different strains and cultur e medium. T he necessary steps of biofilm formation include init ial attachment, the formation of micro co lonies and co ag gregation. [ K ey words] biofilm; Differ ent medium; M icr o titer plate assay; CL SM -

齲病是一種慢性細菌性疾病, 現(xiàn)代齲病病因?qū)W認(rèn) 為, 牙菌斑是典型的生物膜結(jié)構(gòu), 是齲病發(fā)生的始動因 子。口腔中牙菌斑生物膜是由多種微生物在牙面上沉 積的有機基質(zhì)中互相集聚、 交聯(lián)而形成的生態(tài)結(jié)構(gòu), 生 物膜中各種微生物相互依存, 相互競爭, 構(gòu)成了復(fù)雜的 生態(tài)關(guān)系。大量研究表明, 生物膜細菌與浮游細菌在 生長代謝, 致病性, 對藥物的敏感性等方面都有顯著差
* 基金項目: 國家自然科學(xué)基金資助項目( 30430800) * * 通訊作者: 周學(xué)東 Tel : 028- 85501439 * * * 趙今現(xiàn)在新疆醫(yī)科大學(xué)口腔系

異。細菌生物膜對宿主防御系統(tǒng)有較強的抵抗力, 耐 受性強, 對抗生素敏感性下降, 具有空間和環(huán)境的多樣 性, 能表達不同于浮游細菌的表型。本研究目的是在 體外探索一種簡單和高效的細菌生物膜形成的方法, 了解口腔細菌在體外形成生物膜的能力、 形成過程及 不同培養(yǎng)條件對生物膜形成的影響, 并通過激光共聚 焦掃描顯微鏡( CL SM ) 觀察細菌生物膜的形成及結(jié)構(gòu) 特征, 為進一步研究口腔細菌生物膜的藥物敏感實驗 奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

324 材料和方法
1. 實 驗 菌 株及 菌 懸 液 制 備

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物膜的形成情況并繪制生長曲線。 5. 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察不 同培養(yǎng) 條件下 細菌生 物 膜形成及結(jié)構(gòu) 用于細胞培養(yǎng)直徑 15 mm 無菌蓋 玻片放入 24 孔細胞培養(yǎng)皿中, 每孔加入 細菌懸液 500 L , 培養(yǎng)基 1500 L, 每種細菌分 3 種不同培養(yǎng)基條件: BHI、 5 及 人唾液 培養(yǎng)基, BM 每組培養(yǎng)基 2 個平 行樣, 重 復(fù) 3 次實驗, 以 不加 菌懸液 培養(yǎng) 的 玻片為背景對照。分別于 6 h、 h、 h 和 48 h 取 出相應(yīng)的玻 12 24 片, PBS 洗玻片 2 次去除 表面浮游細菌, 室溫 下暗箱中 Fluores cein( 熒光黃 10 mg / L ) 染 色孵育 80 min, 蒸 餾水洗 玻片 2 次 去 除殘留染液。染色的生物膜標(biāo)本于 CLSM 下觀察, 觀察條件 為 氬激光( 514/ 488 nm) , He N e 激光( 534 nm) , 物鏡 像。 6. 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS10. 0 軟 件進 行分析, 運 用單 因 素方差分析法比較判斷組間差別, 用 T urkey 法進行兩兩比較。 20, 掃描 圖

變 形 鏈 球 菌 Streptococcus

mutans( S. mutans) AT CC 25175、 血鏈球菌 Streptococcus sang uis ( S. sanguis) AT CC 10556、 氏 放 線 菌 Actinomy ces naeslundii 芮 ( A. naeslundii) WU V 627、 粘性放線菌 A ctinomyces viscosus( A. v iscosus ) AT CC 19246、 酸 桿 菌 L actobacillus r hamnosus( L. 乳 r hamnosus ) AC 413 由口腔生物醫(yī)學(xué)工程教育部重 點實驗室微 生物室提供 。將復(fù)蘇 48 h 的 菌種接 種于 BHI 液體 培養(yǎng) 基中, 80% N2 , 20% CO 2, 37 下厭氧培 養(yǎng) 18 h( A. naeslundii 和 A. 10
8

v iscosus 培養(yǎng) 24 h) , 涂片檢查為純培養(yǎng)后比濁儀測 細菌懸液濃 度, 用 P BS 緩 沖 液 將 細 菌 懸 液 調(diào) 1. 0 M cFarland ( 3. 0 CFU / mL) 。 2. 培 養(yǎng)基 選取 3 種培 養(yǎng)基: 牛心腦 浸液培 養(yǎng)基( BHI ) 、 15 min 再過 濾 除菌。 人工唾液( BM 5) 及人唾液。人唾 液由健康 捐獻者提供, 收集 捐 獻者上午非刺激 性全 唾液, 4000 r/ min BH I 和 BM 5 培養(yǎng)基所用 原料中水解酪蛋白、 胃黏膜 蛋白、 豬 胰 蛋白胨為美國 Sigma 公司 產(chǎn) 品, 其 余均 為 北京 化 工試 劑 廠 生 產(chǎn)。 3. 主要試劑設(shè) 備 標(biāo)準(zhǔn) 96 孔微量板( Corning Incorpor ated L, CostorR 3599 ) , Cr ystalT M Spec( tm) 比濁儀( 美國 Becton Dickinson and Company ) , 排 槍 ( T ransferpetterR 8 30 ~ 300 BRAN D 德國) , HT S 7000 PL U S 型多孔板( 熒光/ 紫外光) 高 效 分析儀( 美國 PERK IN ELM ER) , 激光共聚焦掃描顯微鏡( Leica T SCSP2 德國 ) 1% Cr ystal V iolet( w t/ vol) ( Sigma, 美 國) , Fluo rescein C 20H 12O 5( 上 海三愛思試劑有限公司) 。 4. 不同培養(yǎng)條件對細菌生物膜生 長影響 和生長 曲線測 定 取細菌懸液 50 L 加入含 有不 同培 養(yǎng)基 150 L/ 孔的 96 孔 板, 細菌分 3 種不 同培 養(yǎng)基 培養(yǎng): BHI、 5 和 人唾 液培 養(yǎng)基。 BM 80% N 2, 20% CO 2, 37 下厭氧 培養(yǎng), 實驗過程 中每 12 h 更 換 新鮮培養(yǎng)基 150 L/ 孔, 每種培養(yǎng)基 做 4 個平 行孔, 重復(fù) 3 次 實 驗, 以不含菌懸液的孔作為基數(shù)對照。分別在 6 h、 h、 h、 8 12 24 h、 h、 h 和 60 h 取出 相應(yīng)的 96 孔板。吸 出孔 內(nèi)菌 懸液, 36 48 PBS 洗孔 2~ 3 次去除浮游細菌, 微孔 板在室溫下 干燥 30 min, 加入 1% Crystal V iolet 200 L/ 孔, 放 置 20 min 后吸 出 染液, PBS 洗孔 2~ 3 次去除孔壁染液, 孔板在室溫下干燥 30 min , 加 入 95% 乙醇 200 L / 孔微量震蕩器上震蕩 30 min 復(fù)吸染液, 復(fù) 吸液放入一新的 96 孔微量板中, HT S 7000 P LU S 型多孔板( 熒 光/ 紫外光) 高效分析儀分 別測定 OD570, 記 錄各 時間段 細菌 生

結(jié)

果

1. 在不 同培養(yǎng)基條件下細 菌生 物膜的 生長 情況見 圖 1~ 3, 用 HT S7000 分析儀 570 nm 可見光測定細 菌生物膜 時發(fā)現(xiàn), 在體外細菌形成生物膜需要一定的培養(yǎng)條件。3 種不同培養(yǎng)基 條件下, 5 種口腔細 菌在 BHI 和 BM 5 培 養(yǎng)基 中均 能形 成細 菌 生物膜, 而在人唾液培養(yǎng) 條件 下未能 測到 變化的 OD 值。圖 1 是以變形鏈球菌為例根據(jù)各時段測定的不同培養(yǎng)基 條件下 O D 值繪制的細菌生物膜生 長曲 線。圖 2 是在 同樣 的培養(yǎng) 條件 下 ( 以 BHI 培養(yǎng)基為例) 5 種細菌的 生物膜生長 曲線, 觀察到細 菌 生物膜形成表現(xiàn)為緩慢的非線性生長, 出現(xiàn)了一 個相對的生 長 停滯期, 這個時期出 現(xiàn)在 36~ 48 h 之間 , 不同 細菌 略有 差別。 圖 3 觀察到 不同細菌形成生物膜的能力不 同, 對 培養(yǎng)基的選 擇 也有一定差異。統(tǒng)計學(xué)比 較發(fā)現(xiàn), 各 細菌 在 BHI 和 BM 5 培 養(yǎng) 基中形成生物膜的能力無顯著性 差異( P > 0. 05) , 與 人唾液 培 養(yǎng)條件下相 比有顯著 性差 異( P < 0. 05) 。在 同樣 的培 養(yǎng)條 件 下, 5 種細菌形成生物膜的能力無顯著性差異( P > 0. 05) 。 2. CL SM 觀 察細 菌 生 物 膜 生 長, 實 驗 觀 察 到 在 BHI 和 BM 5 培 養(yǎng)基中 5 種細菌生物膜各時段的結(jié)構(gòu)變化過程, 但在 人 唾液培養(yǎng)基中各 細菌 沒有 形成 生 物膜 結(jié)構(gòu)。圖 4~ 7 是 以 S. mutans 為例在 BHI 培 養(yǎng)條件下 6 h, 12 h, 24 h 和 48 h 各時 段 的生物膜形態(tài)。可見體外 細菌 生物膜 的形 成需 經(jīng)歷細 菌定 植 ( 見圖 4) , 彼此間粘附成團( 見 圖 5) , 形 成細菌 微菌落 ( 見 圖 6) 到成熟生物膜結(jié)構(gòu)( 見圖 7) 一系 列過程。在本實驗中 5 種細菌 形成生物膜都經(jīng)歷了以上過程, 只是在時間上 略有差別。

圖1

在不 同培養(yǎng) 基中 S . mut ans 生 物膜生 長曲線

圖 2 同一培養(yǎng)條件不同細菌生物 膜生長曲 線

圖 3 5 種實驗細菌在不同培養(yǎng)基中 48 h 生 物膜生長情況

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圖 4 6 h S. mutans 生物膜結(jié)構(gòu) CLSM 物鏡( 20)

圖5

12 h S. mut ans 生 物膜 結(jié) 構(gòu) CLS M 物鏡( 20)

圖6

24 h S . mut ans 生物 膜結(jié) 構(gòu) CLSM 物鏡( 20)

圖7

48 h S . mut ans 生物 膜 結(jié) 構(gòu) CLSM 物鏡( 20)

討

論

培養(yǎng)基條件, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)無糖的培養(yǎng)基、 缺少 CAA( 酪蛋 白水解后產(chǎn)生的氨基酸) 以及托 黑氏肉湯不產(chǎn)生生物 膜, 大部分的糖類均有利于細菌生物膜的生長。本實 驗使用了 3 種不同的培養(yǎng)基, 結(jié)果發(fā)現(xiàn) BH I 和 BM5 有利于細菌生物膜的形成, BHI 是一種營養(yǎng)豐富的培 養(yǎng)基, 內(nèi)含有一定量的葡萄糖, 人工唾液中的豬胃黏膜 蛋白對生物膜的生長有重要影響[ 10] 。理論上人唾液 應(yīng)有利于細菌生物膜的形成, 但實驗中由于收集的唾 液難以消毒, 采用高速離心加濾菌處理, 這一過程可能 影響了唾液的成分。有研究[ 9] 發(fā)現(xiàn)直接 從人體收集 的唾液經(jīng)濾菌處理后只有放線菌能形成生物膜, 但加 入葡萄糖后鏈球菌就能形成生物膜, 由此可見, 糖和蛋 白質(zhì)在細菌生物膜形成中發(fā)揮著重要的作用。本研究 僅局限于單菌種生物膜, 對多菌種生物膜有待進一部 研究。 [參 考 文 獻]
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研究細菌生物膜的方法有兩大類, 即定性研究和 定量研究。定性研究主要目的是了解細菌生物膜形成 過程及生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu), 主要用不同的顯微鏡作為研 究儀器, CLSM 用于細菌生物膜觀察, 克服了其它顯微 鏡的缺點, 做到原位, 實時, 動態(tài)地觀察細菌生物膜結(jié) 構(gòu)[ 1] 。定量研究 又有半定 量和定量 之分。半 定量研 究方法是將附著于材料表面的生物膜作為一個整體進 行測量, 可見光及普通 熒光測量法即屬 此類方法
[ 2]

。

本實驗?zāi)康闹饕怯^察細菌生物膜形成的條件, 過程 及形態(tài)結(jié)構(gòu)變化, 尚未進行生物膜生長代謝和生理特 性的研究, 因此選擇半定量的 570 nm 可見光測定和 CL SM 的研究方法。 實驗發(fā)現(xiàn)用微孔板測定分析細菌 生物膜的形成是一種簡單、 效、 高 重復(fù)性 好的研究方 法。 細菌生物膜形成過程研究較早, 但直到 CLSM 出 現(xiàn), 生物膜的形成和形態(tài)才比較完整地被觀察到。本 實驗觀察到 5 種口腔細菌在形成生物膜的過程中各有 其特點, 而且都經(jīng)歷了幾個相同的過程: 細菌定植于 載體表面, 6 h 僅有少量散 在的細菌菌落定植于載體 表面( 圖 4) 。有相關(guān)研究表明, 在這一時期細菌會產(chǎn) 生一定的化學(xué)物質(zhì)使細菌 的表型發(fā)生改變 [ 3] 。 細 菌間彼此粘附成團, 散在的細菌很難抵抗環(huán)境的變化, 細胞間的粘附使細菌能適應(yīng)環(huán)境的變化。相互粘附的 細菌間存在一定的孔隙( 見圖 5、 , 這些孔隙作為營 6) 養(yǎng)通道, 排泄通道, 同時為彼此交換代謝產(chǎn)物創(chuàng)造交通 條件
[ 4]

。

成熟細菌生物膜的形成( 見圖 7) , 細菌生
[ 5]

物膜在形成過程中產(chǎn)生大 量的胞外多糖( EPS) , EPS 是成熟 細菌生 物膜結(jié) 構(gòu)的基 礎(chǔ) 細菌耐受外力及干燥環(huán)境等
[ 8]

, 發(fā) 揮著 重要 的作
[ 6、 7]

用, 聚集營養(yǎng), 阻滯藥物進入 細菌生物膜內(nèi)部 。

,使

細菌在 體外形 成生物 膜需要 一定的 培養(yǎng) 條件, Loo CY 等[ 9] 在鏈球菌生物膜的體外實驗中提供各種



  本文關(guān)鍵詞：不同培養(yǎng)條件對口腔細菌生物膜生長的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。