【摘要】：研究背景:急性髓細(xì)胞白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)是一種惡性克隆性血液系統(tǒng)疾病,成人中最常見的急性白血病類型之一。目前常用于AML的治療方法為聯(lián)合化療和造血干細(xì)胞移植,但傳統(tǒng)方法不僅具有明顯的副作用,而且不能有效改善患者的5年以上生存率和完全緩解率,因此開發(fā)新的治療方法迫在眉睫。過去20多年里,大量文獻(xiàn)報(bào)道,白血病干細(xì)胞(Leukemia Stem Cells,LSCs)是AML發(fā)病和耐藥的根源。由于LSCs是由正常造血干細(xì)胞(Hematopoietic Stem Cells,HSCs)衍變而來,所以和HSCs有著許多相似的生物學(xué)特性和表型。LSCs在體內(nèi)具有維持自我更新和處于靜止期的特點(diǎn),是其能夠躲避化療藥物的殺傷,發(fā)生耐藥性的重要起因。從AML患者樣本分離出原代CD34~+CD38~-細(xì)胞群,進(jìn)行異種移植實(shí)驗(yàn),該群細(xì)胞在小鼠體內(nèi)有很強(qiáng)的定植能力,證明LSCs和正常HSCs具有相似的免疫表型,但也為白血病的靶向治療研究提供了難題。因此,有必要尋找出LSCs表面特異性標(biāo)記,探索出能靶向殺傷LSCs而不損害HSCs的治療方法。我們從大量臨床樣本中篩選出免疫球蛋白CD96在AML患者樣本中高表達(dá)但在正常骨髓HSCs中低表達(dá),根據(jù)CD96表達(dá)特點(diǎn)可進(jìn)一步探究其能否成為AML靶向治療的有效靶點(diǎn)。研究目的:研究CD96在AML發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。研究方法:利用TCGA、GSE24395數(shù)據(jù)庫分析CD96表達(dá)與AML患者生存率之間的關(guān)系。設(shè)計(jì)shRNAs(shScramble、shCD96)構(gòu)建慢病毒載體,轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞293T使其產(chǎn)生慢病毒;慢病毒轉(zhuǎn)染至U937和THP-1等AML細(xì)胞系,敲降CD96表達(dá)。轉(zhuǎn)染后利用流式細(xì)胞儀分選出GFP陽性(GFP~+)的細(xì)胞。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法計(jì)算GFP~+shScramble組和GFP~+shCD96組不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)目,繪制細(xì)胞生長曲線;細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力;細(xì)胞表面分化抗原抗體免疫染色法檢測GFP~+shScramble組和GFP~+shCD96組細(xì)胞分化水平;瑞式-吉母薩染色檢測GFP~+shScramble組和GFP~+shCD96組細(xì)胞向粒系-單核細(xì)胞的分化。分別將分選得到的GFP~+shScramble組和GFP~+shCD96組細(xì)胞通過小鼠眼窩靜脈叢移植,15天后解剖小鼠,稱量肝臟和脾臟質(zhì)量,提取外周血、骨髓、肝臟和脾臟細(xì)胞,檢測GFP~+細(xì)胞在小鼠外周血、骨髓、肝臟、脾臟等組織的定植情況。研究結(jié)果:通過數(shù)據(jù)庫分析,與正常HSCs相比,CD96在AML患者LSCs中表達(dá)高出10倍左右。同時(shí),CD96在AML各亞型中均有所表達(dá),尤其在AML-M4和AML-M5亞型中表達(dá)量較高。利用shRNA敲降CD96,與GFP~+shScramble組細(xì)胞相比,GFP~+shCD96組細(xì)胞增殖率明顯下降,細(xì)胞克隆數(shù)目減少,THP-1細(xì)胞CD11b抗原表達(dá)量升高,U937細(xì)胞CD19表達(dá)量上升。瑞式-吉母薩染色結(jié)果顯示,GFP~+shCD96組細(xì)胞有向單核細(xì)胞-粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)的轉(zhuǎn)變。小鼠異種移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GFP~+shScramble組小鼠肝臟、脾臟質(zhì)量明顯大于GFP~+shCD96組,且肝臟中GFP~+細(xì)胞百分率shCD96組比對照組shScramble明顯降低。結(jié)論:CD96在AML患者中高表達(dá),并在AML各亞型患者中表達(dá)具有普遍性,并且影響AML細(xì)胞增殖速率。CD96參與維持AML細(xì)胞的不完全分化狀態(tài),調(diào)控AML細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的定植。CD96可以作為AML靶向治療的一個(gè)潛在靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R733.71

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2762023