發(fā)布時間：2023-08-30 00:14

　　雞γ干擾素(Chicken interferon-gamma, ChIFN-γ)具有較強的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)作用,作為生物藥劑和疫苗佐劑具有廣闊的應用前景。正常情況下,機體產生IFN-γ的數量很有限,一定程度上限制了IFN-γ的應用。本實驗主要采用重組DNA和基因表達技術,通過RT-PCR方法成功克隆雞IFN-γ基因,并對其基因序列進行了分析,旨在為大量制備和生產高效廉價的雞IFN-γ及其體外大量表達作好準備。在體外雞IFN-γ生物學活性研究基礎上,聯合禽流感滅活疫苗免疫研究機體的免疫應答反應,對雞IFN-γ的免疫增強作用進行了研究。 根據GenBank發(fā)表的ChIFN-γ基因序列,設計了一對引物,采用RT-PCR方法,從激活的脾臟淋巴細胞總RNA中擴增出ChIFN-γ基因序列。瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增出的片段約為495 bp。經過雙酶切、PCR鑒定和測序結果顯示,克隆的ChIFN-γ基因與GenBank發(fā)表的雞IFN-γ基因序列同源性為99.8%。將擴增的ChIFN-γ克隆至原核表達載體pET30a上,構建了重組表達質粒pET-30a-ChIFN-γ。將其轉入大腸桿菌BL21 (...

【文章頁數】：65 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 禽流感概述
        1.1.1 禽流感流行現狀
        1.1.2 禽流感病毒分子生物學特征
        1.1.3 基因組的結構及其編碼蛋白的功能
        1.1.4 禽流感疫苗
    1.2 干擾素概述
        1.2.1 IFN 分類及性質
        1.2.2 IFN-γ產生及誘導劑
        1.2.3 IFN-γ生物學活性
        1.2.4 IFN-γ的應用
    1.3 研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗動物
        2.1.2 病毒株
        2.1.3 細胞株、菌株及載體
        2.1.4 主要工具酶、抗體及分子生物學試劑盒
        2.1.5 主要生化試劑
        2.1.6 主要實驗儀器設備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 雞脾淋巴細胞總RNA 分離
        2.2.2 雞IFN-γ基因RT-PCR 擴增
        2.2.3 PCR 擴增片段克隆
        2.2.4 重組質粒鑒定
        2.2.5 雞IFN-γ基因重組表達載體構建
        2.2.6 重組表達質粒鑒定
        2.2.7 重組雞IFN-γ在大腸桿菌表達系統(tǒng)中誘導表達
        2.2.8 融合蛋白純化
        2.2.9 免疫印記分析
        2.2.10 重組蛋白對VSV 感染細胞細胞病變的抑制
        2.2.11 多克隆抗體制備
        2.2.12 多克隆抗體鑒定
        2.2.13 重組雞γ干擾素對禽流感滅活苗的免疫增強效應
    2.3 數據處理
3 試驗結果
    3.1 雞 IFN-γ 基因克隆與序列測定
        3.1.1 雞脾淋巴細胞總RNA 分離
        3.1.2 RT-PCR 法擴增雞IFN-γ基因序列
        3.1.3 重組質粒pMD18-T-ChIFN-γ的鑒定
        3.1.4 ChIFN-γ序列測定及分析
    3.2 雞 IFN-γ 基因在大腸桿菌中的表達及多克隆抗體制備
        3.2.1 重組表達質粒鑒定
        3.2.2 融合蛋白表達、鑒定與純化
        3.2.3 重組蛋白生物活性檢測
        3.2.4 多抗血清效價及特異性鑒定
    3.3 禽流感HI 抗體水平測定
    3.4 雛雞免疫器官及血液T、B 淋巴細胞增殖功能動態(tài)變化
        3.4.1 雛雞胸腺T 淋巴細胞增殖功能動態(tài)變化
        3.4.2 雛雞脾臟T 淋巴細胞增殖功能動態(tài)變化
        3.4.3 雛雞血液T 淋巴細胞增殖功能動態(tài)變化
        3.4.4 雛雞脾臟B 淋巴細胞增殖功能動態(tài)變化
        3.4.5 雛雞血液B 淋巴細胞增殖功能動態(tài)變化
    3.5 雛雞免疫器官及血液不同亞型T 淋巴細胞數量動態(tài)變化
        3.5.1 雛雞免疫器官及血液CD4⁺ T 淋巴細胞動態(tài)變化
        3.5.2 雛雞免疫器官及血液CD8⁺ T 淋巴細胞動態(tài)變化
    3.6 雛雞體重增長測定
    3.7 免疫器官指數測定
    3.8 禽流感病毒感染雛雞病理學觀察
    3.9 免疫攻毒保護率
4 討論
    4.1 雞 IFN-γ 基因克隆與表達
        4.1.1 雞IFN-γ基因克隆與序列
        4.1.2 雞IFN-γ基因表達、純化與生物活性
        4.1.3 多克隆抗體制備及鑒定
    4.2 ChIFN-γ 對禽流感滅活苗免疫增強效應
        4.2.1 雛雞免疫后HI 抗體水平變化
        4.2.2 雛雞免疫后T、B 淋巴細胞增殖功能變化
        4.2.3 雛雞免疫后不同亞型T 細胞數量動態(tài)變化
        4.2.4 雛雞增重及免疫器官指數變化
        4.2.5 禽流感病毒攻擊雛雞病理學變化及免疫保護率
5 結論
致謝
參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文



本文編號：3844559