鷹嘴豆α-淀粉酶抑制劑CL-AI的制備、生物學特性及立體結構解析
發(fā)布時間:2021-04-08 07:53
鷹嘴豆種子中含有蛋白類α-淀粉酶抑制劑,這種抑制劑屬于糖苷酶抑制劑的一種,它能有效地抑制腸道內產生的淀粉酶的活性,阻礙食物中碳水化合物的水解和消化,減少糖分的攝取,降低血糖和血脂的含量,減少脂肪合成,從而減輕體重;而對哺乳動物、昆蟲以及微生物來源的α-淀粉酶也有很強的特異性抑制作用。α-淀粉酶抑制劑具有很重要的藥用價值,是一種用于防治各種糖尿病、高血糖、高血脂及肥胖癥等疾病的新型藥物。同時α-淀粉酶抑制劑在農業(yè)上可作為抗蟲基因或將其直接制成生物農藥,對病蟲害防治、減少化學殺蟲劑使用,減少環(huán)境破壞和維持生態(tài)平衡等方面有重要的應用價值。本實驗室前期研究中發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆α-淀粉酶抑制劑抑制活力在不同品種間存在顯著的基因型差異,并從籽粒中克隆出貯藏球蛋白型α-淀粉酶抑制候選基因CL-AI,其ORF全長1494 bp,編碼497個氨基酸。在之前的研究基礎上,本實驗開展以下幾方面的研究:①鷹嘴豆α-淀粉酶抑制劑CL-AI基因及其CL-AI-α、CL-AI-ββ亞基編碼蛋白的原核表達和純化;②CL-AI基因重組蛋白生物學特性研究;③CL-AI蛋白的初步晶體生長及篩選。主要研究結果如下:1.將CL-AI基...
【文章來源】:南京農業(yè)大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】:101 頁
【學位級別】:碩士
【部分圖文】:
圖1-4?BASI-AMY2復合物的三維結構圖譜??Fig.?1-4?The?three-dimensional?structure?map?of?the?BAS1-AMY2?complex.??
為化學發(fā)光檢測底物工作液(一張8cm2PVDF膜用lmL工作液);??(13)棄去TBST緩沖液,將發(fā)光底物工作液滴加在印跡膜上,確保工作液覆蓋張膜,用吸水紙吸去多余的發(fā)光底物工作液;??(14)將膜置于化學發(fā)光成像儀中曝光成像;??2實驗結果??2.1?CU/基因及其亞基C/-J/■,的亞克隆??如圖2-1-A為鷹嘴豆a-淀粉酶抑制劑C/-J/基因ORF的結構,其ORF全包括l-63bp的信號肽序列、64-933bp的a鏈亞基序列,934-1491bp的(3鏈亞序列。分別采用表2-3的引物進行PCR擴增,擴增產物由1.5%的瓊脂糖電泳測,結果如圖1所示:分別得到CU/、C/-J/-a、C/d/^兩端帶酶切位點(BamI和Xhol)的完整序列,大小分別為1428?bp、870?bp、558?bp,特異性強、無帶、與已知序列大小相符,通過測序確定這些擴增片段為目的片段。??
達載體PE-SUM03連接,并將連接產物進行PCR鑒定。重組質粒(:丨-八1-??pE-SUM03、CI-AI-a-pE-SUM03、CI-AI-|3-pE-SUM03?出現(xiàn)單一條帶,與預期片??段大小相符(圖2-2)。將檢測正確的菌液進行測序,測序結果表明原核表達載??體構建成功。??BamHI?Xhol??cl-ai??CL-Al-a??pSUM03?Amp??伽哞,?CL-Al-P??I????M?1?2?3??i?bp??ki?pSUM03?Amp??_?ft74)6p??1203bp??891bp??25〇l??10〇l??圖2-2重組質粒的PCR檢測??M:DNA?相對分子質;W;標準?DL2000;?1、2?和?3:?CNAI-a-pE-SUM03、CI-AI-P-pE-SUM03、??C1-A卜pE-SUM03?產物??Fig.2-2?Identification?of?recombinant?plasmids?by?PCR?amplification??M:?DL2000?marker;?1,2?and?3:?PCR?amplification?of?CI-AI-a-pE-SUM03,?CI-AI-p-pE-SUIV103,??CI-AI-pE-SUM03??2.3原核表達產物的檢測??將重組質粒?CI-AI-pE-SUM03、CI-AI-a-pE-SUM03、CI-AI-(3-pE-SUM03?分??別轉入大腸桿菌表達菌株R〇setta(DE3)中,分別取其全菌、上清進行SDS-PAGE??檢測
【參考文獻】:
期刊論文
[1]溫度對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中表達的影響[J]. 周洪波,林福來,鄭甲,郭寧,吳俊子,吳麗雙,邱冠周. 當代化工. 2013(04)
[2]鷹嘴豆不同品種種子α-淀粉酶抑制劑抑制活性[J]. 郝小燕,崔竹梅,魯海菊,顧愛星,麻浩. 西北農業(yè)學報. 2013(03)
[3]親和標簽在重組蛋白表達與純化中的應用[J]. 陳愛春,彭偉,汪生鵬. 中國生物工程雜志. 2012(12)
[4]重組蛋白表達系統(tǒng)的研究進展[J]. 范翠英,馮利興,樊金玲,果德安,劉璇. 生物技術. 2012(02)
[5]蛋白質分離純化方法研究進展[J]. 吳少輝,劉光明. 中國藥業(yè). 2012(01)
[6]蛋白質分離純化方法的研究進展[J]. 王紅穎,王倩,黃瑾. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展. 2011(S2)
[7]外源基因在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達[J]. 高炳淼,李寶珠,于津鵬,胡遠艷,長孫東亭,羅素蘭. 中國生物工程雜志. 2011(11)
[8]α-淀粉酶蛋白類抑制劑的研究進展[J]. 魏鵬娟,王魯峰,徐曉云,潘思軼. 食品科學. 2011(09)
[9]鷹嘴豆的應用價值及其研究與利用[J]. 張金波,苗昊翠,王威,熱依拉,李利民. 作物雜志. 2011(01)
[10]糖尿病治療藥物的研究進展[J]. 李雅玲,李珊,李富華. 臨床合理用藥雜志. 2010(11)
本文編號:3125167
【文章來源】:南京農業(yè)大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】:101 頁
【學位級別】:碩士
【部分圖文】:
圖1-4?BASI-AMY2復合物的三維結構圖譜??Fig.?1-4?The?three-dimensional?structure?map?of?the?BAS1-AMY2?complex.??
為化學發(fā)光檢測底物工作液(一張8cm2PVDF膜用lmL工作液);??(13)棄去TBST緩沖液,將發(fā)光底物工作液滴加在印跡膜上,確保工作液覆蓋張膜,用吸水紙吸去多余的發(fā)光底物工作液;??(14)將膜置于化學發(fā)光成像儀中曝光成像;??2實驗結果??2.1?CU/基因及其亞基C/-J/■,的亞克隆??如圖2-1-A為鷹嘴豆a-淀粉酶抑制劑C/-J/基因ORF的結構,其ORF全包括l-63bp的信號肽序列、64-933bp的a鏈亞基序列,934-1491bp的(3鏈亞序列。分別采用表2-3的引物進行PCR擴增,擴增產物由1.5%的瓊脂糖電泳測,結果如圖1所示:分別得到CU/、C/-J/-a、C/d/^兩端帶酶切位點(BamI和Xhol)的完整序列,大小分別為1428?bp、870?bp、558?bp,特異性強、無帶、與已知序列大小相符,通過測序確定這些擴增片段為目的片段。??
達載體PE-SUM03連接,并將連接產物進行PCR鑒定。重組質粒(:丨-八1-??pE-SUM03、CI-AI-a-pE-SUM03、CI-AI-|3-pE-SUM03?出現(xiàn)單一條帶,與預期片??段大小相符(圖2-2)。將檢測正確的菌液進行測序,測序結果表明原核表達載??體構建成功。??BamHI?Xhol??cl-ai??CL-Al-a??pSUM03?Amp??伽哞,?CL-Al-P??I????M?1?2?3??i?bp??ki?pSUM03?Amp??_?ft74)6p??1203bp??891bp??25〇l??10〇l??圖2-2重組質粒的PCR檢測??M:DNA?相對分子質;W;標準?DL2000;?1、2?和?3:?CNAI-a-pE-SUM03、CI-AI-P-pE-SUM03、??C1-A卜pE-SUM03?產物??Fig.2-2?Identification?of?recombinant?plasmids?by?PCR?amplification??M:?DL2000?marker;?1,2?and?3:?PCR?amplification?of?CI-AI-a-pE-SUM03,?CI-AI-p-pE-SUIV103,??CI-AI-pE-SUM03??2.3原核表達產物的檢測??將重組質粒?CI-AI-pE-SUM03、CI-AI-a-pE-SUM03、CI-AI-(3-pE-SUM03?分??別轉入大腸桿菌表達菌株R〇setta(DE3)中,分別取其全菌、上清進行SDS-PAGE??檢測
【參考文獻】:
期刊論文
[1]溫度對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中表達的影響[J]. 周洪波,林福來,鄭甲,郭寧,吳俊子,吳麗雙,邱冠周. 當代化工. 2013(04)
[2]鷹嘴豆不同品種種子α-淀粉酶抑制劑抑制活性[J]. 郝小燕,崔竹梅,魯海菊,顧愛星,麻浩. 西北農業(yè)學報. 2013(03)
[3]親和標簽在重組蛋白表達與純化中的應用[J]. 陳愛春,彭偉,汪生鵬. 中國生物工程雜志. 2012(12)
[4]重組蛋白表達系統(tǒng)的研究進展[J]. 范翠英,馮利興,樊金玲,果德安,劉璇. 生物技術. 2012(02)
[5]蛋白質分離純化方法研究進展[J]. 吳少輝,劉光明. 中國藥業(yè). 2012(01)
[6]蛋白質分離純化方法的研究進展[J]. 王紅穎,王倩,黃瑾. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展. 2011(S2)
[7]外源基因在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達[J]. 高炳淼,李寶珠,于津鵬,胡遠艷,長孫東亭,羅素蘭. 中國生物工程雜志. 2011(11)
[8]α-淀粉酶蛋白類抑制劑的研究進展[J]. 魏鵬娟,王魯峰,徐曉云,潘思軼. 食品科學. 2011(09)
[9]鷹嘴豆的應用價值及其研究與利用[J]. 張金波,苗昊翠,王威,熱依拉,李利民. 作物雜志. 2011(01)
[10]糖尿病治療藥物的研究進展[J]. 李雅玲,李珊,李富華. 臨床合理用藥雜志. 2010(11)
本文編號:3125167
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