鷹嘴豆種子中含有蛋白類α-淀粉酶抑制劑,這種抑制劑屬于糖苷酶抑制劑的一種,它能有效地抑制腸道內產生的淀粉酶的活性,阻礙食物中碳水化合物的水解和消化,減少糖分的攝取,降低血糖和血脂的含量,減少脂肪合成,從而減輕體重;而對哺乳動物、昆蟲以及微生物來源的α-淀粉酶也有很強的特異性抑制作用。α-淀粉酶抑制劑具有很重要的藥用價值,是一種用于防治各種糖尿病、高血糖、高血脂及肥胖癥等疾病的新型藥物。同時α-淀粉酶抑制劑在農業(yè)上可作為抗蟲基因或將其直接制成生物農藥,對病蟲害防治、減少化學殺蟲劑使用,減少環(huán)境破壞和維持生態(tài)平衡等方面有重要的應用價值。本實驗室前期研究中發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆α-淀粉酶抑制劑抑制活力在不同品種間存在顯著的基因型差異,并從籽粒中克隆出貯藏球蛋白型α-淀粉酶抑制候選基因CL-AI,其ORF全長1494 bp,編碼497個氨基酸。在之前的研究基礎上,本實驗開展以下幾方面的研究:①鷹嘴豆α-淀粉酶抑制劑CL-AI基因及其CL-AI-α、CL-AI-ββ亞基編碼蛋白的原核表達和純化;②CL-AI基因重組蛋白生物學特性研究;③CL-AI蛋白的初步晶體生長及篩選。主要研究結果如下:1.將CL-AI基... 

【文章來源】：南京農業(yè)大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－４?ＢＡＳＩ－ＡＭＹ２復合物的三維結構圖譜??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｍａｐ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＢＡＳ１－ＡＭＹ２?ｃｏｍｐｌｅｘ．??

為化學發(fā)光檢測底物工作液（一張８ｃｍ２ＰＶＤＦ膜用ｌｍＬ工作液）；??（１３）棄去ＴＢＳＴ緩沖液，將發(fā)光底物工作液滴加在印跡膜上，確保工作液覆蓋張膜，用吸水紙吸去多余的發(fā)光底物工作液；??（１４）將膜置于化學發(fā)光成像儀中曝光成像；??２實驗結果??２．１?ＣＵ／基因及其亞基Ｃ／－Ｊ／■，的亞克隆??如圖２－１－Ａ為鷹嘴豆ａ－淀粉酶抑制劑Ｃ／－Ｊ／基因ＯＲＦ的結構，其ＯＲＦ全包括ｌ－６３ｂｐ的信號肽序列、６４－９３３ｂｐ的ａ鏈亞基序列，９３４－１４９１ｂｐ的（３鏈亞序列。分別采用表２－３的引物進行ＰＣＲ擴增，擴增產物由１．５％的瓊脂糖電泳測，結果如圖１所示：分別得到ＣＵ／、Ｃ／－Ｊ／－ａ、Ｃ／ｄ／＾兩端帶酶切位點（ＢａｍＩ和Ｘｈｏｌ）的完整序列，大小分別為１４２８?ｂｐ、８７０?ｂｐ、５５８?ｂｐ，特異性強、無帶、與已知序列大小相符，通過測序確定這些擴增片段為目的片段。??

達載體ＰＥ－ＳＵＭ０３連接，并將連接產物進行ＰＣＲ鑒定。重組質粒（：丨－八１－??ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－｜３－ｐＥ－ＳＵＭ０３?出現(xiàn)單一條帶，與預期片??段大小相符（圖２－２）。將檢測正確的菌液進行測序，測序結果表明原核表達載??體構建成功。??ＢａｍＨＩ?Ｘｈｏｌ??ｃｌ－ａｉ??ＣＬ－Ａｌ－ａ??ｐＳＵＭ０３?Ａｍｐ??伽哞，?ＣＬ－Ａｌ－Ｐ??Ｉ????Ｍ?１?２?３??ｉ?ｂｐ??ｋｉ?ｐＳＵＭ０３?Ａｍｐ??＿?ｆｔ７４）６ｐ??１２０３ｂｐ??８９１ｂｐ??２５〇ｌ??１０〇ｌ??圖２－２重組質粒的ＰＣＲ檢測??Ｍ：ＤＮＡ?相對分子質；Ｗ；標準?ＤＬ２０００；?１、２?和?３：?ＣＮＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－Ｐ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、??Ｃ１－Ａ卜ｐＥ－ＳＵＭ０３?產物??Ｆｉｇ．２－２?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｂｙ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ｍａｒｋｅｒ；?１，２?ａｎｄ?３：?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＣＩ－ＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３，?ＣＩ－ＡＩ－ｐ－ｐＥ－ＳＵＩＶ１０３，??ＣＩ－ＡＩ－ｐＥ－ＳＵＭ０３??２．３原核表達產物的檢測??將重組質粒?ＣＩ－ＡＩ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－（３－ｐＥ－ＳＵＭ０３?分??別轉入大腸桿菌表達菌株Ｒ〇ｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中，分別取其全菌、上清進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ??檢測

【參考文獻】：
期刊論文
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