鷹嘴豆種子中含有蛋白類α-淀粉酶抑制劑,這種抑制劑屬于糖苷酶抑制劑的一種,它能有效地抑制腸道內(nèi)產(chǎn)生的淀粉酶的活性,阻礙食物中碳水化合物的水解和消化,減少糖分的攝取,降低血糖和血脂的含量,減少脂肪合成,從而減輕體重;而對(duì)哺乳動(dòng)物、昆蟲以及微生物來(lái)源的α-淀粉酶也有很強(qiáng)的特異性抑制作用。α-淀粉酶抑制劑具有很重要的藥用價(jià)值,是一種用于防治各種糖尿病、高血糖、高血脂及肥胖癥等疾病的新型藥物。同時(shí)α-淀粉酶抑制劑在農(nóng)業(yè)上可作為抗蟲基因或?qū)⑵渲苯又瞥缮镛r(nóng)藥,對(duì)病蟲害防治、減少化學(xué)殺蟲劑使用,減少環(huán)境破壞和維持生態(tài)平衡等方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆α-淀粉酶抑制劑抑制活力在不同品種間存在顯著的基因型差異,并從籽粒中克隆出貯藏球蛋白型α-淀粉酶抑制候選基因CL-AI,其ORF全長(zhǎng)1494 bp,編碼497個(gè)氨基酸。在之前的研究基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)開展以下幾方面的研究:①鷹嘴豆α-淀粉酶抑制劑CL-AI基因及其CL-AI-α、CL-AI-ββ亞基編碼蛋白的原核表達(dá)和純化;②CL-AI基因重組蛋白生物學(xué)特性研究;③CL-AI蛋白的初步晶體生長(zhǎng)及篩選。主要研究結(jié)果如下:1.將CL-AI基... 

【文章來(lái)源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－４?ＢＡＳＩ－ＡＭＹ２復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)圖譜??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｍａｐ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＢＡＳ１－ＡＭＹ２?ｃｏｍｐｌｅｘ．??

為化學(xué)發(fā)光檢測(cè)底物工作液（一張８ｃｍ２ＰＶＤＦ膜用ｌｍＬ工作液）；??（１３）棄去ＴＢＳＴ緩沖液，將發(fā)光底物工作液滴加在印跡膜上，確保工作液覆蓋張膜，用吸水紙吸去多余的發(fā)光底物工作液；??（１４）將膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光成像；??２實(shí)驗(yàn)結(jié)果??２．１?ＣＵ／基因及其亞基Ｃ／－Ｊ／■，的亞克隆??如圖２－１－Ａ為鷹嘴豆ａ－淀粉酶抑制劑Ｃ／－Ｊ／基因ＯＲＦ的結(jié)構(gòu)，其ＯＲＦ全包括ｌ－６３ｂｐ的信號(hào)肽序列、６４－９３３ｂｐ的ａ鏈亞基序列，９３４－１４９１ｂｐ的（３鏈亞序列。分別采用表２－３的引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由１．５％的瓊脂糖電泳測(cè)，結(jié)果如圖１所示：分別得到ＣＵ／、Ｃ／－Ｊ／－ａ、Ｃ／ｄ／＾兩端帶酶切位點(diǎn)（ＢａｍＩ和Ｘｈｏｌ）的完整序列，大小分別為１４２８?ｂｐ、８７０?ｂｐ、５５８?ｂｐ，特異性強(qiáng)、無(wú)帶、與已知序列大小相符，通過測(cè)序確定這些擴(kuò)增片段為目的片段。??

達(dá)載體ＰＥ－ＳＵＭ０３連接，并將連接產(chǎn)物進(jìn)行ＰＣＲ鑒定。重組質(zhì)粒（：丨－八１－??ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－｜３－ｐＥ－ＳＵＭ０３?出現(xiàn)單一條帶，與預(yù)期片??段大小相符（圖２－２）。將檢測(cè)正確的菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明原核表達(dá)載??體構(gòu)建成功。??ＢａｍＨＩ?Ｘｈｏｌ??ｃｌ－ａｉ??ＣＬ－Ａｌ－ａ??ｐＳＵＭ０３?Ａｍｐ??伽哞，?ＣＬ－Ａｌ－Ｐ??Ｉ????Ｍ?１?２?３??ｉ?ｂｐ??ｋｉ?ｐＳＵＭ０３?Ａｍｐ??＿?ｆｔ７４）６ｐ??１２０３ｂｐ??８９１ｂｐ??２５〇ｌ??１０〇ｌ??圖２－２重組質(zhì)粒的ＰＣＲ檢測(cè)??Ｍ：ＤＮＡ?相對(duì)分子質(zhì)；Ｗ；標(biāo)準(zhǔn)?ＤＬ２０００；?１、２?和?３：?ＣＮＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－Ｐ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、??Ｃ１－Ａ卜ｐＥ－ＳＵＭ０３?產(chǎn)物??Ｆｉｇ．２－２?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｂｙ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ｍａｒｋｅｒ；?１，２?ａｎｄ?３：?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＣＩ－ＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３，?ＣＩ－ＡＩ－ｐ－ｐＥ－ＳＵＩＶ１０３，??ＣＩ－ＡＩ－ｐＥ－ＳＵＭ０３??２．３原核表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)??將重組質(zhì)粒?ＣＩ－ＡＩ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－（３－ｐＥ－ＳＵＭ０３?分??別轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株Ｒ〇ｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中，分別取其全菌、上清進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ??檢測(cè)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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