發(fā)布時間：2020-10-17 22:06

　　 動脈粥樣硬化(As)是一種發(fā)生在大、中動脈的慢性炎癥性疾病。載脂蛋白A-I(apoA-I)的天然半胱氨酸突變體apoA-IMilano(A-IM)和apoA-IParis均表現(xiàn)出增強的心血管保護活性,二聚體是其主要的活性形式。根據(jù)apoA-I的結(jié)構(gòu)特點和上述突變體發(fā)生突變的特殊位置,本課題組自行設(shè)計并構(gòu)建了7個apoA-I的半胱氨酸突變體。我們前期實驗所誘變的半胱氨酸突變體在體外也可以不同程度的形成二聚體,本實驗選用其中極易形成二聚體的A-I(S228C)突變體進行初步研究。 [目的] 原核表達并純化重組蛋白A-I(S228C)、A-IM和野生型AI(WT-AI)。以內(nèi)毒素血癥大鼠為炎癥模型,通過與WT-AI和AIM比較,重點觀察A-I(S228C)突變體的抗炎和抗氧化作用,探討對炎癥和多器官功能損害的保護作用及機制,以期為其抗As提供實驗依據(jù),并為我們深入理解apoA1結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 [方法] 利用pET原核表達系統(tǒng)表達重組蛋白A-I(S228C)、A-IM和WT-AI,Ni2+親和柱進行目的蛋白純化,經(jīng)TritonX-114和Pierce親和柱去除內(nèi)毒素,鱟試劑法檢測內(nèi)毒素合格后與大豆卵磷脂包裝形成脂質(zhì)體。采用陰莖背靜脈注射內(nèi)毒素復(fù)制內(nèi)毒素血癥大鼠模型;30只雄性Wister大鼠隨機分為六組:鹽水對照組(生理鹽水+生理鹽水,n=4)、模型組(生理鹽水+內(nèi)毒素,n=4)、磷脂對照組(大豆卵磷脂+內(nèi)毒素,n=4)、WT-AI組(WT-AI+內(nèi)毒素,n=6)、A-IM組(A-IM+內(nèi)毒素,n=6)和A-I(S228C)突變體組(A-I(S228C)+內(nèi)毒素,n=6)。各組動物實驗前及內(nèi)毒素注射后6小時,剪尾取血,分離血清,采用酶法測定血清脂質(zhì)含量,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-1β, IL-6和粘附分子ICAM-1的含量,試劑盒檢測血清ALT、AST、Urea、Cre和CK等反映肝腎肌組織功能指標的含量,MDA、NO和T-AOC試劑盒測定血清脂質(zhì)過氧化程度及總抗氧化能力。將大鼠固定,PBS灌流,取心、肝、脾、肺、腎組織置于10%中性福爾馬林中固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,HE染色,光鏡觀察組織病理結(jié)構(gòu)改變、白細胞浸潤等。 [結(jié)果] 重組蛋白A-I(S228C)、A-IM和WT-AI表達量超過10mg/L菌液,經(jīng)Ni2+親和柱純化及TritonX-114和Pierce親和柱去除內(nèi)毒素后,純度達到90%,內(nèi)毒素含量達到注射標準。內(nèi)毒素血癥模型大鼠出現(xiàn)炎癥表型。A-I(S228C)突變體組與模型組相比,大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和粘附分子ICAM-1含量(P0.01)以及血清ALT、AST、Urea、Cre和CK水平顯著降低(均為P0.05);血清MDA和NO含量顯著降低(分別為:P0.01和P0.05);機體總抗氧化能力顯著增加(P0.01);光鏡觀察肺組織病理結(jié)構(gòu)改變和白細胞浸潤得到明顯改善。 [結(jié)論] 1、獲得大量高純度的WT-AI及A-IM、A-I(S228C)突變體蛋白。 2、成功復(fù)制內(nèi)毒素血癥大鼠模型。 3、重組蛋白A-I(S228C)能降低大鼠血清炎癥因子及粘附分子水平。 4、重組蛋白A-I(S228C)能增強大鼠機體的總抗氧化能力,并抑制血清脂質(zhì)過氧化。 5、重組蛋白A-I(S228C)能降低大鼠血清肝、腎、肌功能指標含量,改善肺組織病理結(jié)構(gòu)改變及白細胞浸潤,提示對大鼠肝臟、腎臟、肺臟、骨骼肌和心肌等多種組織器官具有保護作用,其保護作用機制可能與其抗炎和抗氧化作用有關(guān)。 6、重組蛋白A-I(S228C)的抗炎、抗氧化及對多器官功能損害的保護作用與 A-IM比較未見明顯差異,是否同樣具有抗As作用有待于進一步探討。
【學位單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2007
【中圖分類】：R543
【部分圖文】：

第一部分 重組蛋白的原核表達、純化，內(nèi)毒素的去及脂質(zhì)體包裝一、重組蛋白的原核表達及純化分別利用科室保存的 WT-AI 及 A-IM、A-I(S228C)兩種半胱氨酸pET-30b(+)重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)宿主表達菌，1mM IPTG 誘導(dǎo)表達小時后，超聲破碎菌體，分離上清和沉淀，經(jīng) 12% SDS－PAGE 電泳，考馬斯色，可見重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)菌體裂解液中明顯表達的目的蛋白帶，分預(yù)期相同，為 29kD；超聲破菌結(jié)果顯示，apoA-I 等蛋白主要以可溶性形式上清中(圖 1)。因所有目的蛋白 C-末端都帶有組氨酸 6 聚體標簽，可經(jīng) Ni2+親和柱純化純化后經(jīng) 12% SDS－PAGE(還原型)電泳鑒定純度>90%(圖 1，圖 2)。純化蛋白約為 10-12mg/L 菌液，與前期實驗結(jié)果相一致[23](圖 1，2)。

為了觀察我們所表達的 WT-AI、AIM和 AI-228 三種蛋白二硫鍵形成情用氧化型和還原型 SDS-PAGE 兩種電泳對其進行檢測（圖 2）：所有蛋白白定量后，取相同蛋白量上樣，經(jīng)過相同的處理，所不同的是部分加入還原型 SDS-PAGE，部分未加 DTT，進行氧化型 SDS-PAGE。電泳結(jié)果顯示在溶液中仍以單體形式存在；apoA-I 半胱氨酸突變體 A-I(S228C)，單通過二硫鍵形成二聚體，從而使得該蛋白在溶液中主要以二聚體形式存入 DTT 還原后仍有部分蛋白以二聚體形式存在，而 A-IM二聚體的I(S228C)突變體相對減少，加入 DTT 使二聚體完全還原為單體。

大鼠肺臟病理結(jié)構(gòu)改變的比較（10×10）
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 楊一新;李桂源;;LPS所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進展[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2006年01期

2 祝學衛(wèi),吳剛,曾武威,薛紅,陳保生;人載脂蛋白A-Ⅰ半胱氨酸突變體的二級結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)結(jié)合能力的比較[J];中國生物化學與分子生物學報;2005年05期

3 孫同柱,付小兵,姚詠明,楊銀輝,陳偉,趙志力,孫曉慶;一種較好的雄性大鼠靜脈給藥途徑[J];實驗動物科學與管理;2002年01期

本文編號：2845365