本文關(guān)鍵詞：靈芝三萜和金銀花綠原酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的挖掘及分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》 2013年

靈芝三萜和金銀花綠原酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的挖掘及分析

徐曉蘭  

【摘要】：闡明中藥生物活性成分的次生代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制是現(xiàn)代中藥研究的重要內(nèi)容之一。次生代謝工程在提高藥用植物目標(biāo)產(chǎn)物含量上有著極大的應(yīng)用潛能,但受傳統(tǒng)研究方法和技術(shù)所限,目前我們對(duì)其次生代謝途徑及調(diào)控機(jī)制的認(rèn)知還較為粗略,因而期望通過次生代謝工程獲取大量的目標(biāo)次生代謝物仍面臨著較大困難。功能基因組學(xué)(Functional Genomics)是在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(Structural Genomics)的基礎(chǔ)上,利用后者提供的信息,應(yīng)用高通量測(cè)序產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù),在基因組或轉(zhuǎn)錄組水平上全面研究基因的表達(dá)、調(diào)控與功能,并探索基因之間、基因與蛋白質(zhì)之間、基因及其產(chǎn)物與生長(zhǎng)發(fā)育之間的相互聯(lián)系和規(guī)律。通過全基因組學(xué)或轉(zhuǎn)錄組學(xué)系統(tǒng)分析次生代謝物的生物合成途徑并發(fā)掘與之相關(guān)的基因,能夠使我們更充分地了解中藥的遺傳信息與背景,也將使利用次生代謝工程生產(chǎn)重要藥效成分成為可能。靈芝和金銀花是具有極高藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的傳統(tǒng)中藥,靈芝三萜和綠原酸分別是靈芝和金銀花的主要藥效成分之一,但目前對(duì)這些重要化合物的生物合成途徑仍缺少系統(tǒng)的研究。本課題采用功能基因組學(xué)研究方法從全基因組水平上對(duì)藥用真菌赤芝全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析,以探索可能參與到靈芝三萜生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因；運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)藥用植物金銀花的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究,以闡明其重要成分綠原酸的生物合成途徑,并對(duì)相關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆。本研究為靈芝三萜和綠原酸的生物合成研究奠定了基礎(chǔ)。 靈芝GANODERMA,又稱"Lingzhi",為赤芝Ganoderma lucidum或紫芝Ganoderma sinense的干燥子實(shí)體(中國(guó)藥典2010版),是我國(guó)著名的藥用真菌之一�，F(xiàn)代藥理研究表明靈芝有抗腫瘤,抗高血壓,抗病毒和增強(qiáng)免疫能力的功效,靈芝三萜類和靈芝多糖為該功效的主要活性物質(zhì)。赤芝全基因組已由本課題組完成測(cè)序,該物種基因組大小為43.3MB,共有16,113個(gè)預(yù)測(cè)蛋白的編碼基因。本研究在赤芝全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中,鑒定了參與靈芝三萜合成上游途徑的11個(gè)關(guān)鍵酶,其中乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶(AACT)和法尼基焦磷酸合成酶(FPS)各有兩個(gè)編碼基因,其余都為單編碼基因；發(fā)現(xiàn)了214個(gè)可能參與到靈芝三萜下游合成途徑的候選細(xì)胞色素氧化酶基因(CYP450),其中195個(gè)可能具有真正的P450功能包括6個(gè)兼性P450(bifunctional P450, BiP450),這195個(gè)P450s分屬于24個(gè)基因簇。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR (QRT-PCR)檢測(cè),78個(gè)P450基因與羊毛甾醇合酶(LAS)共表達(dá),說明此78個(gè)P450很有可能參與到靈芝三萜骨架的結(jié)構(gòu)修飾中。78個(gè)P450中,有28個(gè)為赤芝所獨(dú)有的新家族,另38個(gè)基因在其他物種中之前已被報(bào)道過。此外,24個(gè)基因簇中有5個(gè)與LAS共表達(dá),它們極有可能是以基因簇的方式參與到靈芝三萜的合成途徑中。 金銀花LONICERA JAPONICA FLOS為忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或待初開的花。為我國(guó)傳統(tǒng)臨床用藥之一,具有抗炎,抗氧化和抗病毒的藥理學(xué)特性,主要活性成分為綠原酸(Chlorogenic acid, CGA)和木犀草苷(Luteoloside)。綠原酸和木犀草苷的生物合成途徑在其他物種中已有一定的研究,但在金銀花中還未見報(bào)道與證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用454GSFLxTitanium高通量測(cè)序平臺(tái),對(duì)金銀花的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序,完成了金銀花葉和花2個(gè)cDNA文庫(kù)測(cè)序,分別構(gòu)建了花和葉的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tag, EST)文庫(kù)。從花的EST文庫(kù)中拼接得到21849個(gè)疊連群(contig),38187個(gè)單一序列(singleton);從葉的EST文庫(kù)中獲得14242個(gè)疊連群,40557個(gè)單一序列。應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)所得EST序列從功能基因組水平上研究了綠原酸的次生代謝途徑。在金銀花中發(fā)現(xiàn)了幾乎所有的參與綠原酸生物合成的酶,其中包括羥基肉桂�；o酶A：奎尼酸羥基肉桂轉(zhuǎn)移酶(HQT)和羥基肉桂�；o酶A：莽草酸/奎尼酸的羥基肉桂轉(zhuǎn)移酶(HCT),同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了所有參與木犀草苷生物合成的酶。本實(shí)驗(yàn)通過RACE技術(shù)克隆了8個(gè)HQT和HCT基因,得到全長(zhǎng)cDNA序列。與其它物種中已知的HQT和HCT氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)其中2個(gè)HQT和1個(gè)HCT具有真正的保守結(jié)構(gòu)域。此外,分析了其它參與次生代謝過程的重要基因包括P450和轉(zhuǎn)錄因子等。最后,通過花與葉的EST數(shù)據(jù)庫(kù)的比較,挖掘到分別在花和葉中表達(dá)的組織特異性基因。金銀花轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序工作為關(guān)鍵酶基因的挖掘提供了基礎(chǔ),并為進(jìn)一步克隆其全長(zhǎng)、研究其功能提供了依據(jù),同時(shí)也作為金銀花遺傳標(biāo)記、基因表達(dá)、基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的重要數(shù)據(jù)來源。 全基因組及轉(zhuǎn)錄組分析在中藥次生代謝途徑的研究中有著至關(guān)重要的作用,為相關(guān)酶基因的克隆、鑒定,以及揭示完整的次生代謝途徑提供了豐富的基因信息。本研究獲得了靈芝三萜和綠原酸生物合成途徑的信息,并挖掘了與金銀花生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因,為中藥次生代謝工程合成靈芝三萜及綠原酸奠定了理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：S567.31;S567.79
【目錄】：

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3 陳莉;;三萜皂甙生物合成途徑及其關(guān)鍵酶的研究概述[A];廣西生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要[C];2003年

4 張上隆;;植物類胡蘿卜素的生物合成及其調(diào)控[A];張上隆果樹學(xué)文選[C];2006年

5 夏濤;高麗萍;韋朝領(lǐng);劉亞軍;王云生;高可君;張憲林;楊冬青;孫美蓮;王正榮;張立明;;茶樹兒茶素生物合成研究進(jìn)展[A];中國(guó)茶葉科技創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)發(fā)展學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

6 楊錦芬;陳蔚文;何國(guó)振;徐暉;何瑞;詹若挺;王永炎;;陽(yáng)春砂萜類成分生物合成上游功能基因的研究[A];中國(guó)植物學(xué)會(huì)七十五周年年會(huì)論文摘要匯編（1933-2008）[C];2008年

7 張興國(guó);李貞霞;鄧小燕;蘇成剛;劉佩瑛;;魔芋葡甘聚糖生物合成研究進(jìn)展[A];中國(guó)園藝學(xué)會(huì)第五屆青年學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2002年

8 宋東輝;侯李君;宋西峰;施定基;;藍(lán)藻脂肪酸合成途徑乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆與穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建[A];中國(guó)海洋湖沼學(xué)會(huì)藻類學(xué)分會(huì)第七屆會(huì)員大會(huì)暨第十四次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2007年

9 高東堯;馬蘭青;韓俊友;李彥舫;;高山紅景天紅景天甙生物合成代謝途徑初探[A];中國(guó)植物學(xué)會(huì)七十五周年年會(huì)論文摘要匯編（1933-2008）[C];2008年

10 陳道付;金海濤;李紹鈺;;赭曲霉毒素A對(duì)肉雞的危害[A];河南省畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)第七屆理事會(huì)第二次會(huì)議暨2008年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 蒲昭和;[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2007年

2 庾晉 子蔭;[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2003年

3 王純;[N];中藥報(bào);2001年

4 本報(bào)記者　 徐亞靜;[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

5 庾晉 子萌;[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2002年

6 本報(bào)記者 鄭紅艷;[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2009年

7 李生;[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

8 海南康農(nóng)堂藥用植物研究所高級(jí)農(nóng)藝師 陳康林;[N];科技日?qǐng)?bào);2003年

9 操秀英;[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

10 ;[N];中國(guó)信息報(bào);2003年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 徐曉蘭;靈芝三萜和金銀花綠原酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的挖掘及分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

2 徐江;基于全基因組的靈芝藥用模式真菌創(chuàng)建研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

3 龐永珍;銀杏黃酮和萜類化合物生物合成途徑中重要相關(guān)基因的克隆和研究[D];復(fù)旦大學(xué);2005年

4 李殷;植物維生素E生物合成途徑及調(diào)控[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

5 吳耀生;藥用植物三七三萜合成途徑功能酶特征與植物三萜合成通路分子進(jìn)化[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2008年

6 王力生;苦玄參的化學(xué)成分研究及應(yīng)用[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2004年

7 馬蘭青;高山紅景天紅景天甙生物合成相關(guān)基因的克隆及功能分析[D];吉林大學(xué);2005年

8 葉立斌;靈芝子實(shí)體多糖（綴合物）的純化、結(jié)構(gòu)鑒定、分子改性和生物活性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 王鵬;通過RNA介導(dǎo)的基因抑制對(duì)煙堿代謝調(diào)控的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

10 楊柳青;蛇根木阿嗎靈生物合成途徑中三個(gè)重要酶的表達(dá)，純化，結(jié)晶，，三維結(jié)構(gòu)表征及催化機(jī)理研究[D];浙江大學(xué);2011年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 谷曉策;基于改造茉莉酸甲酯生物合成途徑的丹參次生代謝工程新策略[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

2 周蓉;靈芝三萜的提取及其對(duì)α-鵝膏毒肽所致肝損傷的保護(hù)作用研究[D];湖南師范大學(xué);2011年

3 齊川;不同來源靈芝主要活性成分變異[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2012年

4 姚松君;靈芝三萜的超聲波提取工藝及其指紋圖譜檢測(cè)方法的研究[D];華南理工大學(xué);2010年

5 張?jiān)录t;青錢柳葉三萜類化合物提取純化、分離鑒定及其抑菌活性研究[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

6 劉志梅;3種金銀花的光合生理特性及耐旱性研究[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2012年

7 方磊;苔蘚植物地錢的化學(xué)成分研究[D];山東大學(xué);2007年

8 丁一新;靈芝法呢基焦磷酸合酶基因的克隆和表達(dá)特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 彭惺蓉;無柄靈芝與反柄紫芝的化學(xué)成分及生物活性研究[D];云南農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

10 敖宏;靈芝蛋白的提取、酶解及抗氧化性能研究[D];華南理工大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：靈芝三萜和金銀花綠原酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的挖掘及分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：99435