本文關(guān)鍵詞：鱘源海豚鏈球菌的分離鑒定及莢膜多糖基因的進(jìn)化分析

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【摘要】：2013年8-9月,四川雅安漢源湖養(yǎng)殖的西伯利亞鱘發(fā)生一種以體表潰瘍、內(nèi)臟出血和心外膜囊腫為特征的傳染病。為明確其病因,本研究從自然發(fā)病魚的肝、脾和腎進(jìn)行涂片檢查和病原菌的分離、人工感染、分離菌的表型特征和分子生物學(xué)特征的檢測。肝臟和脾臟涂片均觀察到大量的革蘭氏陽性球菌,從患病魚體內(nèi)分離到一株優(yōu)勢(shì)菌,革蘭氏染色呈G+鏈狀球菌(Ab130920)。人工感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)分離株能夠引起試驗(yàn)魚高死亡率,明確了其病原性。生理生化特性檢測,除對(duì)精氨酸和乳糖反應(yīng)外,與海豚鏈球菌(Streptococcus iniae,S.iniae) (ATCC29178)基本一致；16S rDNA序列(GenBank登錄號(hào)：KJ162337)與GenBank中S.iniae 16S rDNA序列同源性最高,在以16S rDNA序列及其GenBank中同源性較高的相關(guān)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上,分離菌與S.iniae聚為一族;同時(shí),在基于S.iniae乳酸氧化酶基因的特異性PCR檢測中,從分離株基因組DNA擴(kuò)增出預(yù)期大小的870 bp條帶,綜合表型特征和分子學(xué)特征檢測結(jié)果,進(jìn)而鑒定分離菌Ab130920為S.iniae,藥物敏感性檢測發(fā)現(xiàn)其對(duì)阿莫西林、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考等抗菌藥物敏感,但對(duì)新生霉素、利福平、氧氟沙星耐藥。為研究其毒力,本試驗(yàn)進(jìn)行了血清殺菌實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)分型、對(duì)EPC細(xì)胞的粘附和侵染實(shí)驗(yàn)、毒力基因檢測和自然發(fā)病魚的病理學(xué)損傷研究。結(jié)果表明,菌株在健康西伯利亞鱘的血清中存活率為66.2%,說明血清僅能夠殺死部分細(xì)菌,存活細(xì)菌可能隨著血液循環(huán)引起全身性的感染；通過對(duì)精氨酸和乳糖反應(yīng)以及隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記分析,證實(shí)Ab130920為血清學(xué)Ⅱ型；其對(duì)EPC細(xì)胞的粘附率為3.28%,侵入率為0.08%,證明菌株可粘附在宿主細(xì)胞表面進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)定殖；在對(duì)cpsD、simA、sagA、pdi和scpl等5種S. iniae毒力基因的多重PCR檢測中,分離菌均擴(kuò)增出相應(yīng)大小的特異性片段,表明其為一毒力較強(qiáng)的菌株,與人工感染實(shí)驗(yàn)的高致病性結(jié)果相佐證;組織病理學(xué)表明,Ab130920引起西伯利亞鱘全身性感染,導(dǎo)致多個(gè)組織器官的出血、細(xì)胞變性和壞死,尤其是肝、腎、脾、心和肌肉的嚴(yán)重?fù)p傷,表現(xiàn)為壞死性肝炎、肝血管炎、腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、急性脾炎、心肌炎、桑葚心和骨骼肌的壞死性肌炎;另外鰓、胃腸道、腦和胰腺也出現(xiàn)不同程度的損傷,表現(xiàn)鰓小片炎、胃炎、腸炎、腦膜炎和胰腺廣泛性出血。為研究其莢膜多糖基因的進(jìn)化關(guān)系,對(duì)菌株Ab130920和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29178的莢膜多糖基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并克隆測序,獲得其序列,并與相關(guān)文獻(xiàn)和GenBank中莢膜多糖基因進(jìn)行多序列比對(duì),明確英膜多糖基因的變異性,分析其堿基突變引起相應(yīng)氨基酸的改變。選擇變異性較大的基因cpsD,與相關(guān)文獻(xiàn)和GenBank中的莢膜多糖基因序列進(jìn)行貝葉斯進(jìn)化分析。結(jié)果表明,S.iniae莢膜多糖基因存在變異的有cpsY、cpsC、cpsD、cpsE、cpsG和cpsY基因,特別是cpsD和cpsE;變異基因在相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生插入、缺失或移碼突變,引起相應(yīng)氨基酸改變；選擇cpsD基因進(jìn)行貝葉斯進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)分離的鱘源S.iniae Ab130920變異程度高。
【關(guān)鍵詞】：西伯利亞鱘 海豚鏈球菌 分離鑒定 毒力研究 莢膜多糖 進(jìn)化分析
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S941.4
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-25
• 1 鱘魚的養(yǎng)殖與病害11-13
• 1.1 鱘魚的生物學(xué)特性及養(yǎng)殖狀況11
• 1.2 鱘魚的主要疾病11-13
• 2 S.iniae研究進(jìn)展13-23
• 2.1 S.iniae的分類及生物學(xué)特性13-14
• 2.2 S.iniae的感染及癥狀14-19
• 2.3 S.iniae致病機(jī)制及毒力因子19-22
• 2.4 防治22-23
• 3 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x23-25
• 第二章 鱘源S.iniae的分離鑒定25-40
• 1 材料25-26
• 1.1 試驗(yàn)菌株及試驗(yàn)動(dòng)物25
• 1.2 主要儀器25
• 1.3 主要試劑25-26
• 2 方法26-28
• 2.1 病原檢測26
• 2.2 人工感染26-27
• 2.3 菌株鑒定27-28
• 2.4 藥物敏感性試驗(yàn)28
• 3 結(jié)果28-37
• 3.1 剖解及臨床癥狀觀察28-30
• 3.2 病原檢測結(jié)果30-31
• 3.3 人工感染31-32
• 3.4 菌株鑒定32-34
• 3.5 分子學(xué)鑒定34-36
• 3.6 藥物敏感性試驗(yàn)36-37
• 4 討論37-40
• 4.1 Siniae感染現(xiàn)狀37-38
• 4.2 Siniae的鑒定38-39
• 4.3 S iniae的藥物敏感性39-40
• 第三章 分離株的毒力研究40-55
• 1 材料40-41
• 1.1 試驗(yàn)菌株和試劑40
• 1.2 主要儀器40
• 1.3 主要試劑40-41
• 2 方法41-44
• 2.1 血清殺菌實(shí)驗(yàn)41
• 2.2 菌株對(duì)EPC細(xì)胞的粘附與侵染41-42
• 2.3 菌株血清型分型42-43
• 2.4 菌株主要毒力基因檢測43
• 2.5 自然感染西伯利亞鱘的病理損傷研究43-44
• 3 結(jié)果44-51
• 3.1 血清殺菌實(shí)驗(yàn)44
• 3.2 菌株對(duì)EPC細(xì)胞的粘附和入侵44-45
• 3.3 血清學(xué)分型45
• 3.4 菌株主要毒力基因檢測45-46
• 3.5 自然感染S.iniae西伯利亞鱘病理學(xué)損傷46-51
• 4 討論51-55
• 4.1 S.iniae的血清學(xué)分型51-52
• 4.2 S.iniae的毒力因子52-53
• 4.3 組織病理學(xué)損傷53-55
• 第四章 基于S.iniae莢膜多糖基因的進(jìn)化分析55-70
• 1 試驗(yàn)材料55
• 1.1 試驗(yàn)菌株/載體55
• 1.2 主要試劑55
• 1.3 主要儀器55
• 2 試驗(yàn)方法55-61
• 2.1 引物設(shè)計(jì)與合成55-56
• 2.2 S.iniae莢膜多糖cps基因的PCR擴(kuò)增56-57
• 2.3 莢膜多糖基因的T載體克隆57-58
• 2.4 S.iniae cps基因多樣性分析58
• 2.5 cpsD基因的貝葉斯進(jìn)化分析58-61
• 3 結(jié)果61-66
• 3.1 莢膜多糖cps基因PCR擴(kuò)增61-62
• 3.2 cps基因多樣性分析62-63
• 3.3 莢膜多糖基因突變及其編碼氨基酸變異分析63-65
• 3.4 基于cpsD基因貝葉斯進(jìn)化分析65-66
• 4 討論66-69
• 4.1 S.iniae cps基因多樣性66-68
• 4.2 cpsD基因的進(jìn)化分析68-69
• 5 結(jié)論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-77
• 作者攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文77-78
• 致謝78

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 祝t熈，

本文編號(hào)：980674