本文關(guān)鍵詞：孕酮受體膜組分1基因在半滑舌鰨生殖功能的研究

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【摘要】：以半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis Günther)為研究對(duì)象,運(yùn)用cDNA末端快速克隆技術(shù)、組織學(xué)切片、熒光實(shí)時(shí)定量(qRT-PCR)、RNA原位雜交、免疫組織化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、顯微注射技術(shù)、Western-blotting等方法;獲得了孕酮受體膜組分1(Progesterone receptor membrane component1,PGRMC1)的cDNA全長(zhǎng)序列,對(duì)PGRMC1在性成熟雌魚的組織表達(dá)及分布和在繁殖周期腦、垂體、卵巢中的表達(dá)特征進(jìn)行了分析;對(duì)PGRMC1在不同發(fā)育時(shí)相的卵母細(xì)胞的表達(dá)特征進(jìn)行了定量和定性研究;添加外源激素處理下,分析體外培養(yǎng)不同發(fā)育時(shí)相的卵母細(xì)胞中PGRMC1基因和蛋白的表達(dá)特征;對(duì)PGRMC1敲降與卵母細(xì)胞成熟關(guān)系進(jìn)行分析;通過上述研究為探討PGRMC1在半滑舌鰨生殖功能奠定基礎(chǔ),同時(shí)為提高鲆鰈類的人工繁殖技術(shù)提供了理論依據(jù)。研究結(jié)果如下:1.PGRMC1基因的克隆及組織和周期表達(dá)特征采用RACE方法,從半滑舌鰨卵巢中克隆了PGRMC1全長(zhǎng)cDNA。半滑舌鰨PGRMC1基因全長(zhǎng)為1335bp,其開放閱讀框?yàn)?46bp,編碼了含181個(gè)氨基酸的蛋白;將推斷的氨基酸序列與其他物種PGRMC1氨基酸序列進(jìn)行多重比較分析,發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨PGRMC1具有1個(gè)跨膜區(qū)域,在二級(jí)結(jié)構(gòu)上與其他物種的PGRMC1具有很高的保守性;氨基酸序列與青溕(Oryzias latipes)同源性最高達(dá)到82.9%;與青斑河渶(Tetraodon nigroviridis)同源性為81.2%;系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示半滑舌鰨PGRMC1與其他溕形目和渶形目魚類聚為一個(gè)分支。qRT-PCR結(jié)果表明,PGRMC1 mRNA組織表達(dá)具有廣泛性,但表達(dá)量存在差異,在卵巢組織中相對(duì)表達(dá)量最高(P0.05);半滑舌鰨垂體、腦和卵巢中PGRMC1 mRNA表達(dá)水平在不同卵巢發(fā)育時(shí)期的變化特性顯示,卵巢中PGRMC1 mRNA表達(dá)水平在卵巢發(fā)育各個(gè)階段都有較高表達(dá)水平(P0.05),垂體和腦中PGRMC1 mRNA在II到V期表達(dá)水平明顯低于卵巢(P0.05);并且卵巢PGRMC1 mRNA表達(dá)水平在產(chǎn)卵期(V期)達(dá)峰值。2.半滑舌鰨PGRMC1在不同組織中基因和蛋白定位分析分析半滑舌鰨PGRMC1蛋白序列選擇抗原表位,并合成相應(yīng)的免疫多肽;將合成的多肽常規(guī)免疫新西蘭大白兔,制備抗體。使用多克隆抗體進(jìn)行Western-blotting檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平,多克隆抗體用合成的多肽封閉檢測(cè)特異性。通過Western-blotting技術(shù)分析半滑舌鰨不同組織中PGRMC1的蛋白表達(dá)量情況。通過RNA原位雜交、免疫組化等方法分析舌鰨不同組織切片中PGRMC1mRNA和蛋白的分布情況。免疫印跡結(jié)果顯示:PGRMC1蛋白在性腺、腦中表達(dá)量較高,在腎、頭腎、垂體組織中也有表達(dá),但表達(dá)量相對(duì)較低;說明PGRMC1主要在性腺、腦組織中發(fā)揮作用。RNA原位雜交結(jié)果顯示:在卵巢成熟期中,PGRMC1 mRNA的陽(yáng)性信號(hào)在卵母細(xì)胞的膜上分布明顯,即PGRMC1在卵母細(xì)胞膜上顯著性表達(dá),進(jìn)一步證明PGRMC1可能在膜/細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)參與重要的細(xì)胞過程。在舌鰨肝臟、腎臟、頭腎、腦、垂體也都檢測(cè)到PGRMC1陽(yáng)性信號(hào),分布于組織的不同部位。PGRMC1在肝臟主要定位在膽小管和肝靜脈等與外界聯(lián)系的管腔周圍,在腎臟中觀察到其在腎小管附近表達(dá)豐富。從形態(tài)學(xué)上解析PGRMC1在不同組織中的表達(dá)特點(diǎn),表明其在不同組織中能夠介導(dǎo)孕激素行使不同生理作用。3.半滑舌鰨PGRMC1在不同發(fā)育時(shí)相卵母細(xì)胞中的表達(dá)量變化通過qRT-PCR和Western-blotting技術(shù)研究了性成熟半滑舌鰨PGRMC1mRNA在卵巢發(fā)育IV期和V期不同發(fā)育時(shí)相卵母細(xì)胞的表達(dá),以及不同濃度HCG處理對(duì)卵巢發(fā)育V期魚不同發(fā)育時(shí)相卵母細(xì)胞PGRMC1基因和蛋白的表達(dá)影響。結(jié)果顯示:在不同發(fā)育期卵巢中,PGRMC1 mRNA的表達(dá)最高值出現(xiàn)在半滑舌鰨卵母細(xì)胞的不同發(fā)育時(shí)相,但整體趨勢(shì)大體一致。在卵巢發(fā)育IV期,處于IV時(shí)相的卵母細(xì)胞PGRMC1 mRNA表達(dá)量最高(P0.05)。在卵巢發(fā)育V期,處于V時(shí)相卵母細(xì)胞PGRMC1 mRNA表達(dá)量最高(P0.05)。卵母細(xì)胞PGRMC1 mRNA表達(dá)的最高值出現(xiàn)在性腺發(fā)育V期,舌鰨的V時(shí)相卵母細(xì)胞,表明PGRMC1主要在成熟階段發(fā)揮作用。采用不同濃度HCG處理卵巢發(fā)育V期舌鰨不同時(shí)相的卵母細(xì)胞,并對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:20IU/ml HCG對(duì)PGRMC1 mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用比10IU/ml HCG作用更明顯,表明PGRMC1 mRNA和蛋白表達(dá)對(duì)HCG調(diào)控作用存在劑量依存關(guān)系。并且HCG對(duì)舌鰨不同時(shí)相的卵母細(xì)胞的促成熟作用效果不同,在V時(shí)相促進(jìn)作用最明顯(P0.05),表明PGRMC1主要在成熟階段發(fā)揮作用。HCG激素調(diào)控作用下,PGRMC1的正向應(yīng)答效應(yīng)預(yù)示其參與了卵母細(xì)胞成熟調(diào)控。4.半滑舌鰨PGRMC1敲降研究基因敲降技術(shù)是研究基因功能的一種重要的實(shí)驗(yàn)手段。本研究以體外培養(yǎng)的半滑舌鰨卵母細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料,設(shè)計(jì)合成PGRMC1-Morpholino抑制半滑舌鰨PGRMC1基因的功能,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組、注水組、反義組、反義對(duì)照組四個(gè)平行組,顯微注射,然后運(yùn)用qRT-PCR方法和Western-blotting方法檢測(cè)顯微注射后卵母細(xì)胞PGRMC1 mRNA和蛋白表達(dá)特征,研究PGRMC1表達(dá)下調(diào)對(duì)半滑舌鰨卵母細(xì)胞成熟過程的影響,為進(jìn)一步探討PGRMC1在半滑舌鰨繁殖過程的功能提供基礎(chǔ)資料。
【關(guān)鍵詞】：孕酮受體膜組分1 卵母細(xì)胞成熟 激素調(diào)控 基因敲降 表達(dá)分析
【學(xué)位授予單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 引言10-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-24
• 1. 硬骨魚類下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）調(diào)控研究12-14
• 2. 孕酮受體膜組分的研究進(jìn)展14-22
• 2.1 孕酮受體膜組分的研究歷程14-16
• 2.1.1 孕酮受體膜組分 114-16
• 2.1.2 孕酮受體膜組分 216
• 2.2 孕酮受體膜元件1的生物結(jié)構(gòu)和生理學(xué)功能16-22
• 2.2.1 PGRMC1結(jié)構(gòu)特征16-17
• 2.2.2 PGRMC1的生理學(xué)功能17-22
• 3. 本研究的目的與意義22-24
• 第二章 半滑舌鰨PGRMC1基因的克隆及組織和周期表達(dá)特征24-42
• 1. 材料25-26
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料25
• 1.2 相關(guān)試劑的配制25-26
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法26-31
• 2.1 卵巢發(fā)育時(shí)期的確定26
• 2.2 總RNA的提取26-27
• 2.3 半滑舌鰨PGRMC1基因保守序列的克隆27-28
• 2.3.1 cDNA合成27-28
• 2.3.2 PGRMC1 cDNA保守序列的克隆28
• 2.4 PGRMC1基因cDNA全長(zhǎng)克隆28-29
• 2.4.1 PGRMC1的 5’-RACE cDNA和 3’-RACE cDNA合成28
• 2.4.2 PGRMC1的 5’-RACE和 3’-RACE28-29
• 2.5 序列分析29
• 2.6 PGRMC1基因mRNA在性成熟雌魚的組織表達(dá)特征29-31
• 2.6.1 PGRMC1引物設(shè)計(jì)29-30
• 2.6.2 PGRMC1 cDNA第一鏈合成30
• 2.6.3 PGRMC1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作30
• 2.6.4 PGRMC1 mRNA在性成熟雌魚的組織表達(dá)特征30
• 2.6.5 數(shù)據(jù)處理30-31
• 2.7 半滑舌鰨PGRMC1 mRNA在繁殖周期腦、垂體、卵巢中的表達(dá)31
• 3 結(jié)果與分析31-38
• 3.1 半滑舌鰨繁殖周期卵巢組織學(xué)分析31-32
• 3.2 PGRMC1序列分析32-34
• 3.3 PGRMC1系統(tǒng)進(jìn)化分析34
• 3.4 PGRMC1氨基酸序列比對(duì)及同源性分析34-36
• 3.5 PGRMC1基因mRNA在性成熟雌魚的組織表達(dá)特征36
• 3.6 PGRMC1基因mRNA在繁殖周期腦、垂體、卵巢中的表達(dá)36-38
• 4. 討論38-42
• 4.1 半滑舌鰨PGRMC1基因的生物信息學(xué)分析38-39
• 4.2 半滑舌鰨PGRMC1時(shí)空表達(dá)與生理功能分析39-42
• 第三章 半滑舌鰨PGRMC1的組織定位和分布42-64
• 1. 材料43-48
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料43
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器43
• 1.3 試劑及耗材43-48
• 1.3.1 組織切片實(shí)驗(yàn)主要試劑44
• 1.3.2 原位試劑及其配制方法44-47
• 1.3.3 Western-blotting試劑47-48
• 1.3.4 免疫組化相關(guān)試劑48
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法48-52
• 2.1 H.E染色石蠟切片48
• 2.2 PGRMC1／PBST-18質(zhì)粒的構(gòu)建48-49
• 2.3 地高辛標(biāo)記PGRMC1正、反義RNA探針的合成和純化49
• 2.4 切片原位雜交分析49-50
• 2.5 PGRMC1多克隆抗體制備及組織蛋白表達(dá)50-51
• 2.6 免疫組化51-52
• 2.7 統(tǒng)計(jì)分析52
• 3. 結(jié)果52-61
• 3.1 PGRMC1蛋白在組織的表達(dá)52-53
• 3.2 PGRMC1蛋白的細(xì)胞學(xué)定位53-57
• 3.3 PGRMC1基因的細(xì)胞學(xué)定位57-61
• 4. 討論61-64
• 4.1 PGRMC1組織的表達(dá)與定位分析61-62
• 4.2 PGRMC1生理學(xué)作用分析62-64
• 第四章 卵母細(xì)胞PGRMC1的表達(dá)特征和敲降分析64-76
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料與方法64-67
• 1.1 材料64-65
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料64-65
• 1.1.2 儀器和藥品65
• 1.1.3 注射物的準(zhǔn)備65
• 1.2 方法65-67
• 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)65-66
• 1.2.2 卵母細(xì)胞的顯微注射66
• 1.2.3 PGRMC1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)66
• 1.2.4 PGRMC1的Western-blotting分析66-67
• 1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析67
• 2. 結(jié)果67-73
• 2.1 PGRMC1在不同時(shí)相卵母細(xì)胞中的表達(dá)67-71
• 2.1.1 卵母細(xì)胞成熟過程中PGRMC1時(shí)序表達(dá)67-68
• 2.1.2 促性腺激素調(diào)控不同時(shí)相卵母細(xì)胞PGRMC1的表達(dá)68-71
• 2.2 孕激素誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟71
• 2.3 卵母細(xì)胞PGRMC1顯微注射分析71-72
• 2.4 基因敲降后卵母細(xì)胞PGRMC1的表達(dá)分析72-73
• 3. 討論73-76
• 3.1 卵母細(xì)胞成熟過程PGRMC1的表達(dá)分析73-74
• 3.2 PGRMC1敲降對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響74-75
• 3.3 PGRMC1參與卵母細(xì)胞成熟的重要基因75-76
• 參考文獻(xiàn)76-88
• 攻讀碩士學(xué)位期間撰寫的學(xué)術(shù)論文88-90
• 致謝90-94

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10 陳彩芳;四種細(xì)胞色素P450酶在半滑舌鰨繁殖生理機(jī)能中的作用研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 趙敏;飼料中不同水平�；撬岷土孜r粉對(duì)半滑舌鰨繁殖性能及后代質(zhì)量的影響[D];上海海洋大學(xué);2015年

2 邢賀飛;半滑舌鰨抗病相關(guān)SNP標(biāo)記的篩選及兩種免疫相關(guān)基因的克隆與初步分析[D];上海海洋大學(xué);2015年

3 吳婭紅;半滑舌鰨LGR8基因克隆和CSW3基因的功能驗(yàn)證[D];上海海洋大學(xué);2015年

4 修旺珊;半滑舌鰨DKKL-1基因的克隆與表達(dá)分析[D];大連海洋大學(xué);2015年

5 向晉松;半滑舌鰨補(bǔ)體調(diào)控因子I的鑒定、重組表達(dá)、功能分析及C3-1基因的初步研究[D];上海海洋大學(xué);2015年

6 宋超;半滑舌鰨性別分化的遺傳特性研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 史學(xué)營(yíng);養(yǎng)殖半滑舌鰨無眼側(cè)黑化機(jī)制的初步研究[D];上海海洋大學(xué);2015年

8 劉田田;半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis）R-spondin1和R-spondin3基因的克隆與表達(dá)分析[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

9 楊芳;半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）R-spondin2基因的分子克隆、表達(dá)模式及其在肌肉發(fā)育過程中功能的初步探究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

10 黃政舉;半滑舌鰨IGF1和IGF2基因SNP與mRNA表達(dá)和生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：971515