本文關(guān)鍵詞：龍眼DlGI和DlFKF1基因的克隆及功能研究

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【摘要】：龍眼(Dimocarpus longan Lour.)是重要的亞熱帶果樹。本試驗(yàn)以‘紅核子’和‘四季蜜’龍眼為材料,克隆龍眼GIGANTEA (GI)和FLAVIN-BINDING, KELCH REPEAT, F-BOX1(FKFl)基因,初步研究龍眼兩個(gè)基因的功能,研究結(jié)果有助于了解龍眼GI和FKFl的功能以及開花調(diào)控的分子機(jī)制。本試驗(yàn)主要獲得了以下研究結(jié)果：1.以‘紅核子’龍眼葉芽為試驗(yàn)材料,克隆了龍眼GI和FKFl同源基因cDNA編碼區(qū)全長序列,命名為DIGI和DlFKFl。熒光定量PCR分析DIGI和DIFKF1在‘紅核子’龍眼花芽分化過程中的表達(dá)。結(jié)果顯示,在11月份(龍眼花芽分化生理分化期),DIGI和DIFKF1基因表達(dá)量均達(dá)到頂峰,在2月份(龍眼花芽分化進(jìn)入形態(tài)分化期),DIGI和DIFKF1的表達(dá)量最低。2.將DIGI和DIFKF1構(gòu)建植物重組表達(dá)載體,農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入擬南芥中,對(duì)轉(zhuǎn)基因植株表型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)。在長日照條件下,DIGI和DIFKF1過量表達(dá)導(dǎo)致促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥不定根的形成和早花現(xiàn)象,熒光定量PCR結(jié)果表明DIGI和DIFKF1促進(jìn)擬南芥體內(nèi)生長素的合成。在短日照條件下,DIGI過量表達(dá)擬南芥表現(xiàn)出早花現(xiàn)象,而DIFKF1過量表達(dá)使擬南芥表現(xiàn)出晚花現(xiàn)象,同時(shí)兩種轉(zhuǎn)基因植株都出現(xiàn)下胚軸伸長的現(xiàn)象；同時(shí)通過熒光定量PCR對(duì)赤霉素合成途徑中關(guān)鍵基因在擬南芥根和葉片的表達(dá)結(jié)合液相色譜數(shù)據(jù)表明,DIGI擬南芥和DIFKF1擬南芥GA3的激素水平均顯著低于野生型,說明短日照下,DIGI和DIFKF1抑制擬南芥體內(nèi)GA3的合成,同時(shí)DlGI有促進(jìn)開花的功能。結(jié)合龍眼花芽分化過程DIGI和DIFKF1在生理分化期表達(dá)量上升的現(xiàn)象,推測(cè)DIGI和DIFKF1在龍眼中可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素水平促進(jìn)花芽分化。3.將構(gòu)建好的DIGI和DIFKF1基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化普通煙草,DIGI和DIFKF1轉(zhuǎn)基因煙草都表現(xiàn)出不定根增加的現(xiàn)象,DIGI煙草的根長顯著比對(duì)照短,與長日照條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型相似,進(jìn)一步驗(yàn)證了DIGI和DIFKF1能調(diào)控激素合成的功能。同時(shí)在兩個(gè)品種的轉(zhuǎn)基因煙草中,都出現(xiàn)了不同時(shí)期的生理落花現(xiàn)象。4.以‘紅核子’和‘四季蜜’龍眼DNA為材料,分別克隆出DIGI基因1338 bp和1587 bp啟動(dòng)子,序列分析顯示,‘紅核子’和‘四季蜜’啟動(dòng)子中有22個(gè)相同的順式元件,有10個(gè)不同的順式元件,‘四季蜜’中存在著TCA-element、TGA-element Unnamed-2特有的順式元件,紅核子僅有一個(gè)特有的順式元件MBSI,DIGI在兩個(gè)龍眼品種中的表達(dá)差異可能與啟動(dòng)子的順式元件差異有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：龍眼 DlGI基因 DlFKF1基因 激素 開花時(shí)間 啟動(dòng)子
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S667.2
【目錄】：

• 摘要10-11
• Abstract11-13
• 縮寫詞13-14
• 第一章 前言14-20
• 1 植物生物鐘14-17
• 1.1 擬南芥的生物鐘15-16
• 1.2 生物鐘與開花調(diào)控16-17
• 2 GI的研究進(jìn)展17-18
• 3 FKF1的研究進(jìn)展18-19
• 4 本研究的目的和意義19-20
• 第二章 龍眼DlGI和DlFKF1基因的克隆與表達(dá)分析20-33
• 1 試驗(yàn)材料20-21
• 1.1 植物材料20
• 1.2 試劑20
• 1.3 感受態(tài)細(xì)胞和克隆載體20
• 1.4 引物合成及測(cè)序20-21
• 1.5 儀器設(shè)備21
• 2 試驗(yàn)方法21-23
• 2.1 總RNA的提取及純化21
• 2.2 cDNA的合成21
• 2.3 引物設(shè)計(jì)與合成21-22
• 2.4 DlGI和DlFKF1基因片段的PCR擴(kuò)增22
• 2.5 目的片段的回收22
• 2.6 載體與目的片段的連接22
• 2.7 產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化22-23
• 2.8 測(cè)序及結(jié)果分析23
• 2.9 DlGI和DlFKF1基因的表達(dá)分析23
• 3 結(jié)果與分析23-31
• 3.1 ‘紅核子’龍眼RNA的提取23-24
• 3.2 DlGI和DlFKF1基因的克隆24-30
• 3.3 龍眼DlGI和DlFKF1基因在花芽分化過程的表達(dá)30-31
• 4 討論31-33
• 第三章 龍眼DlGI和DlFKF1基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化擬南芥33-52
• 1 材料和儀器33-34
• 1.1 材料33
• 1.2 根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞及載體33
• 1.3 試劑與試驗(yàn)儀器33
• 1.3.1 試劑33
• 1.3.2 儀器設(shè)備33
• 1.4 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件33-34
• 2 試驗(yàn)方法34-35
• 2.1 龍眼DlGI和DlFKF1(帶有酶切位點(diǎn))的克隆34
• 2.2 龍眼DlGI和DlFKF1基因表達(dá)載體的構(gòu)建34-35
• 2.3 DlGI和DlFKF1與表達(dá)載體的連接35
• 2.4 DlGI和DlFKF1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌35
• 2.5 DlGI和DlFKF1重組質(zhì)粒的驗(yàn)證35
• 3 DlGI和DlFKF1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌35-37
• 3.1 DlGI和DlFKF1重組質(zhì)粒的提取35-36
• 3.2 根癌農(nóng)桿菌GV3103的活化及感受態(tài)細(xì)胞制備36
• 3.3 DlGI和DlFKF1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV310336
• 3.4 DlGI和DlFKF1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3103驗(yàn)證36-37
• 4 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DlGI和DlFKF1基因轉(zhuǎn)化擬南芥37
• 4.1 擬南芥的播種37
• 4.2 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化37
• 4.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選37
• 4.4 擬南芥的移栽37
• 5 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的分子鑒定37-39
• 5.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株DNA的提取37-38
• 5.2 DNA鑒定38
• 5.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株RNA的提取38
• 5.4 半定量檢測(cè)38
• 5.5 熒光定量PCR檢測(cè)38-39
• 6 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型的觀測(cè)和統(tǒng)計(jì)39
• 7 短日照下擬南芥轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源激素含量(GA_3、IAA)的測(cè)定39-40
• 7.1 擬南芥內(nèi)源激素的提取39
• 7.2 擬南芥內(nèi)源激素含量的測(cè)定39-40
• 8 結(jié)果與分析40-50
• 8.1 DlGI和DlFKF1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建40-41
• 8.2 pSAKDlGI和pSAKDlFKF1導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌41-42
• 8.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選42-43
• 8.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定43-44
• 8.5 T_3代轉(zhuǎn)基因擬南芥性狀觀察44-50
• 8.5.1 長日照下轉(zhuǎn)基因擬南芥表型變化44-47
• 8.5.1.1 根部表型差異44-45
• 8.5.1.2 開花時(shí)間表型差異45-46
• 8.5.1.3 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根部IAA關(guān)鍵合成酶的表達(dá)分析46-47
• 8.5.2 短日照下轉(zhuǎn)基因擬南芥表型變化47-50
• 8.5.2.1 根部表型差異47-48
• 8.5.2.2 開花時(shí)間表型差異48-49
• 8.5.2.3 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根部GA_3關(guān)鍵合成酶的表達(dá)分析49-50
• 8.5.2.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源激素GA_3水平的測(cè)定50
• 9 討論50-52
• 第四章 龍眼DlGI和DlFKF1基因轉(zhuǎn)化煙草52-58
• 1 材料和儀器52
• 1.1 植物材料52
• 1.2 DlGI和DlFKF1植物表達(dá)載體52
• 1.3 試劑與儀器設(shè)備52
• 1.4 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件52
• 1.4.1 培養(yǎng)基配方52
• 1.4.2 植物培養(yǎng)條件52
• 2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DlGI和DlFKF1基因轉(zhuǎn)化普通煙草52-53
• 2.1 煙草的莖段培養(yǎng)及外植體預(yù)培養(yǎng)52-53
• 2.2 煙草外植體的轉(zhuǎn)化53
• 2.2.1 侵染液的制備53
• 2.2.2 侵染53
• 2.3 煙草抗性芽的篩選53
• 2.4 抗性芽的生根培養(yǎng)53
• 2.5 抗性植株煉苗及移栽53
• 3 煙草抗性植株的分子鑒定53-54
• 3.1 煙草抗性植株DNA的提取54
• 3.2 DNA鑒定54
• 3.3 轉(zhuǎn)基因煙草植株主要植物學(xué)性狀的觀測(cè)54
• 4 結(jié)果與分析54-57
• 4.1 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DlGI和DlFKF1基因轉(zhuǎn)化普通煙草54
• 4.2 煙草轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定54-55
• 4.3 轉(zhuǎn)基因煙草性狀觀察55-57
• 4.3.1 轉(zhuǎn)基因煙草的根部生長差異55-56
• 4.3.2 轉(zhuǎn)基因煙草的開花情況56-57
• 5 討論57-58
• 第五章 龍眼DlGI啟動(dòng)子的克隆58-68
• 1 材料和儀器58
• 1.1 植物材料58
• 1.2 試劑58
• 1.3 感受態(tài)和克隆載體58
• 1.4 引物合成及測(cè)序58
• 1.5 儀器設(shè)備58
• 2 試驗(yàn)方法58-61
• 2.1 ‘紅核子’和‘四季蜜’龍眼的DNA提取58-59
• 2.2 物設(shè)計(jì)與合成59
• 2.3 DlGI基因啟動(dòng)子克隆59-61
• 2.4 DlGI基因啟動(dòng)子全長驗(yàn)證61
• 2.5 目的片段的回收61
• 2.6 載體與目的片段的連接61
• 2.7 產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化61
• 2.8 測(cè)序及結(jié)果分析61
• 3 結(jié)果與分析61-66
• 3.1 ‘四季蜜’與‘紅核子’龍眼DNA的提取62
• 3.2 DlGI啟動(dòng)子的克隆62-63
• 3.3 ‘紅核子’和‘四季蜜’龍眼DlGI啟動(dòng)子序列比較63-66
• 4 討論66-68
• 第六章 總結(jié)與展望68-69
• 參考文獻(xiàn)69-76
• 致謝76

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 黃芬娜;龍眼DlGI和DlFKF1基因的克隆及功能研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：959121