發(fā)布時(shí)間：2017-09-29 23:25

  本文關(guān)鍵詞：CXCR4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙熒光報(bào)告基因載體構(gòu)建與活性觀察

  更多相關(guān)文章： CXCR4啟動(dòng)子 乳腺癌細(xì)胞 雙熒光報(bào)告基因載體

【摘要】：趨化因子(chemokines)及其相應(yīng)趨化因子受體(chemokine receptors)不僅參與了胚胎發(fā)育、淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)、血管生成等生物體內(nèi)的各種重要的生命活動(dòng),并且在免疫性疾病及各種腫瘤中發(fā)揮著關(guān)鍵的不可或缺的作用。大量臨床研究表明,乳腺癌患者的乳腺組織與健康人正常乳腺組織相比,CXCR4的表達(dá)量明顯要高,不僅如此,還發(fā)現(xiàn)它的相應(yīng)配體CXCL12在肝、肺、淋巴結(jié)、骨髓等這些癌細(xì)胞常轉(zhuǎn)移去的靶器官組織中也均高表達(dá),表明癌細(xì)胞表達(dá)的趨化因子及其轉(zhuǎn)移的靶器官表達(dá)的相應(yīng)趨化因子受體與靶器官特異轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而,目前關(guān)于CXCR4的研究特別是基因表達(dá)的研究大部分集中在CXCR4日性細(xì)胞和陰性細(xì)胞的混合細(xì)胞,不能完全了解CXCR4單陽(yáng)性細(xì)胞的基因表達(dá)情況。因此,本項(xiàng)研究的目的是擬建立一種用來(lái)分離CXCR4單陽(yáng)性細(xì)胞的方法,以方便對(duì)其基因表達(dá)及體內(nèi)轉(zhuǎn)移行為的研究。本項(xiàng)研究的方法是通過(guò)構(gòu)建一種雙熒光蛋白報(bào)告基因載體,并以CXCR4基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白,以小鼠組成性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)參比報(bào)告基因紅色熒光蛋白,并以此雙熒光蛋白報(bào)告基因轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞,經(jīng)熒光檢測(cè)驗(yàn)證報(bào)告基因活性之后,采用流式細(xì)胞儀技術(shù)分選CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞,進(jìn)而進(jìn)行體外培養(yǎng)觀察CXCR4陽(yáng)性和陰性細(xì)胞的體外生長(zhǎng)特性,為進(jìn)一步開(kāi)展CXCR4陽(yáng)性和陰性細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移的研究奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明,雙熒光蛋白報(bào)告基因載體構(gòu)建成功,體外活性檢測(cè)表示所構(gòu)建的雙熒光報(bào)告基因載體具有活性。以CXCR4特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙熒光蛋白也具有活性。以雙熒光蛋白報(bào)告基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀分選后獲得了CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞,并且經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn),CXCR4 P日性細(xì)胞具有細(xì)胞延展性弱、細(xì)胞偽足較短,貼壁不牢固等生長(zhǎng)特性,CXCR4陰性細(xì)胞具有細(xì)胞延展性強(qiáng),細(xì)胞偽足較長(zhǎng),貼壁牢固的生長(zhǎng)特性。體外培養(yǎng)充分證實(shí)CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞與CXCR4陰性細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)模式,這為進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)研究提供了可靠的依據(jù)。本項(xiàng)研究結(jié)果的意義還在于,利用基因啟動(dòng)子篩選基因表達(dá)陰性和陽(yáng)性的細(xì)胞,相比于用特異性抗體篩選的方法,更有利于保持癌細(xì)胞原始性和完整性,有利于體外培養(yǎng)生長(zhǎng),并對(duì)移植和腫瘤重建不產(chǎn)生影響；本研究構(gòu)建的雙熒光報(bào)告基因載體還可用于其他動(dòng)物基因啟動(dòng)子的替換,分選不同基因表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞,是一種快捷方便的報(bào)告基因載體。并且本研究中克隆的兩段CXCR4啟動(dòng)子在乳腺癌細(xì)胞中均具有足夠啟動(dòng)外源基因表達(dá)的活性,所以可以利用CXCR4啟動(dòng)子特異性的在癌細(xì)胞中啟動(dòng)治療基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤基因治療的靶向性。并且CXCR4上游500bp大小的啟動(dòng)子具有足夠的活性并且序列較短,所以能夠增加載體攜帶外源基因的容量。
【關(guān)鍵詞】：CXCR4啟動(dòng)子 乳腺癌細(xì)胞 雙熒光報(bào)告基因載體
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要9-10
• ABSTRACT10-11
• 第一章 前言11-24
• 1.1 趨化因子及其受體簡(jiǎn)介11-14
• 1.1.1 趨化因子的結(jié)構(gòu)與功能11-12
• 1.1.2 趨化因子受體的結(jié)構(gòu)與功能12-14
• 1.2 趨化因子及其受體對(duì)乳腺癌的調(diào)節(jié)作用14-18
• 1.2.1 趨化因子及其受體對(duì)乳腺癌生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)14-15
• 1.2.2 趨化因子及其受體對(duì)乳腺癌增殖的調(diào)節(jié)15-16
• 1.2.3 趨化因子及其受體對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)16-17
• 1.2.4 趨化因子及其受體與乳腺癌的預(yù)后與治療17-18
• 1.3 趨化因子受體CXCR4在乳腺癌中的研究現(xiàn)狀18-24
• 1.3.1 CXCR4簡(jiǎn)介18-20
• 1.3.2 CXCR4對(duì)乳腺癌的作用20-22
• 1.3.3 CXCR4與乳腺癌的預(yù)后與治療22-24
• 第二章 雙熒光報(bào)告基因載體的構(gòu)建24-46
• 2.1 試驗(yàn)材料24-26
• 2.1.1 試驗(yàn)主要化學(xué)試劑24
• 2.1.2 試驗(yàn)主要儀器24-25
• 2.1.3 耗材25
• 2.1.4 軟件及網(wǎng)絡(luò)資源25
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)相關(guān)質(zhì)粒和引物25-26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-35
• 2.2.1 擴(kuò)增綠色熒光載體EGFP-N1上的CMV啟動(dòng)子26-28
• 2.2.2 去除EGFP-N1多克隆位點(diǎn)的綠色熒光蛋白報(bào)告基因載體的構(gòu)建28-29
• 2.2.3 擴(kuò)增紅色熒光蛋白載體mCherry-N1上的mCherry polyA signal片段29-31
• 2.2.4 含有mCherry polyA signal綠色熒光蛋白報(bào)告基因載體的構(gòu)建31-32
• 2.2.5 擴(kuò)增pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體上的上EFI啟動(dòng)子32-33
• 2.2.6 含有EFI啟動(dòng)子的雙熒光蛋白報(bào)告基因載體的構(gòu)建33-34
• 2.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染34-35
• 2.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析35-46
• 2.3.1 上下游含有多克隆位點(diǎn)CMV啟動(dòng)子的擴(kuò)增35-36
• 2.3.2 目的基因和報(bào)告基因載體的雙酶切36
• 2.3.3 pluspEGFP-N1重組載體的PCR檢測(cè)及測(cè)序36-38
• 2.3.4 mCherry和多聚腺苷酸尾巴的擴(kuò)增38
• 2.3.5 mCherry polyA和pluspEGFP-N1的雙酶切38-39
• 2.3.6 mCherry-pluspEGFP-N1重組載體的PCR檢測(cè)及測(cè)序39-41
• 2.3.7 EFI的擴(kuò)增41
• 2.3.8 EFI啟動(dòng)子與pmCherry- pluspEGFP-N1的雙酶切41-42
• 2.3.9 pEF1-pmCherry-pluspEGFP-N1載體的PCR檢驗(yàn)及測(cè)序42-44
• 2.3.10 pEF1-pmCherry-pluspEGFP-N1雙熒光報(bào)告基因載體的構(gòu)建44-45
• 2.3.11 雙熒光蛋白報(bào)告載體活性的共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)45-46
• 第三章 CXCR4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙熒光報(bào)告基因載體構(gòu)建46-64
• 3.1 試驗(yàn)材料46-47
• 3.1.1 細(xì)胞系46
• 3.1.2 試驗(yàn)主要試劑與耗材46
• 3.1.3 試驗(yàn)主要儀器46-47
• 3.1.4 CXCR4啟動(dòng)子引物47
• 3.2 試驗(yàn)方法47-53
• 3.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇47
• 3.2.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)47-48
• 3.2.3 基因組DNA的提取48
• 3.2.4 細(xì)胞基因組DNA完整性檢測(cè)48
• 3.2.5 CXCR4啟動(dòng)子的擴(kuò)增48-50
• 3.2.6 CXCR4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙熒光報(bào)告基因載體構(gòu)建50-52
• 3.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染52-53
• 3.2.8 熒光蛋白活性的共聚焦顯微鏡檢測(cè)53
• 3.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析53-64
• 3.3.1 基因組DNA提取結(jié)果53-54
• 3.3.2 CXCR4啟動(dòng)子的擴(kuò)增54-55
• 3.3.3 CXCR4啟動(dòng)子和pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1載體的雙酶切55-56
• 3.3.4 CXCR4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙熒光報(bào)告基因載體的雙酶切檢驗(yàn)及測(cè)序56-60
• 3.3.5 CXCR4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙熒光蛋白報(bào)告載體活性的共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)60-61
• 3.3.6 CXCR4啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)分析61-64
• 第四章 CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞與CXCR4陰性細(xì)胞的分選及體外培養(yǎng)64-69
• 4.1 流式細(xì)胞儀分選CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞64-66
• 4.2 細(xì)胞的體外觀察培養(yǎng)66-67
• 4.3 討論67-69
• 參考文獻(xiàn)69-74
• 附錄74-75
• 致謝75

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本文編號(hào)：944849