本文關(guān)鍵詞：一個(gè)擬南芥耐硒基因的克隆及功能分析

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【摘要】：硒是一種重要的微量元素,適量的硒能預(yù)防疾病、延緩衰老、抵抗多種外界脅迫對(duì)機(jī)體造成的損害,過(guò)量的硒則會(huì)有毒害作用,因此,探討植物對(duì)硒耐受機(jī)制,找出真正的植物耐硒關(guān)鍵因子具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。本文從化學(xué)激活型XVE系統(tǒng)中篩選出功能缺失型突變體vse2,鑒定其對(duì)硒有一定的耐受性,通過(guò)Tail-PCR技術(shù)克隆該基因,并初步解析該基因調(diào)控硒耐受的分子機(jī)理。結(jié)果如下：1.從擬南芥XVE突變體庫(kù)中,篩選獲得耐硒突變體vse2,在30μM Na2SeO3和10μM p-estradio+30μM Na2SeO3的培養(yǎng)基中,突變體vse2均表現(xiàn)出耐硒性狀,說(shuō)明突變體vse2對(duì)硒的耐受性與P-estradiol無(wú)關(guān)。2.利用Tail-PCR技術(shù),克隆了擬南芥VSE2基因,該基因?yàn)門PS22(Atlg33750),編碼一個(gè)可能的萜類合成酶,T-DNA插入TPS22基因起始密碼子ATG下游第一個(gè)外顯子的第29個(gè)堿基處�；蛲葱院桶被嵝蛄斜葘�(duì)的結(jié)果顯示,TPS22基因有較高的保守性,并且與琴葉擬南芥有較高的相似性。3. TPS22基因在突變體vse2中表達(dá)量降低,說(shuō)明該突變體是基因敲除型突變體。另外,TPS22基因在不同組織中表達(dá)量水平有差異性,在根中表達(dá)量最高,在花中表達(dá)量最低。4.硒脅迫下,突變體vse2根部和莖部組織中的硒含量均較WT低,同時(shí)檢測(cè)了磷轉(zhuǎn)運(yùn)體HT1;1,發(fā)現(xiàn)PHT1;1在突變體vse2中的表達(dá)量也降低,推測(cè)突變體vse2體內(nèi)積累較少的硒與其轉(zhuǎn)運(yùn)體減少有關(guān)。5.硒代半胱氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶SMT基因在突變體vse2中的表達(dá)量較高,推測(cè)突變體vse2中硒代半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槲谆腚装彼?減少了硒蛋白的毒性。6.硒脅迫下,突變體vse2中GPX1基因表達(dá)和GPX活性上升,說(shuō)明突變體vse2清除脅迫產(chǎn)生的活性氧能力提高。7.硒脅迫下,當(dāng)培養(yǎng)基中加入BSO時(shí),突變體vse2對(duì)硒的耐受性消失；且突變體vse2中的GSH含量和GSH1基因表達(dá)量均升高,說(shuō)明突變體vse2對(duì)硒的耐受性部分依賴GSH途徑。8.進(jìn)一步檢測(cè)CTK含量和相關(guān)基因IPT, TPS25基因的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)硒脅迫下,CTK含量增加,同時(shí)IPT, TPS25基因的表達(dá)量上升,推測(cè)CTK含量上升,與相關(guān)基因IPT, TPS25表達(dá)量上升有關(guān)。9.耐硒突變體vse2對(duì)干旱、甘露醇、低溫脅迫敏感。綜上所述,TPS22基因介導(dǎo)硒耐受的分子機(jī)制可能是：1、硒脅迫下,突變體vse2中磷轉(zhuǎn)運(yùn)體PHT1；1基因表達(dá)量降低,使得進(jìn)入突變體中的硒較少,減少了過(guò)量的硒對(duì)植物的傷害。另外,突變體通過(guò)高水平的表達(dá)SMT和GPX基因,減少錯(cuò)誤硒蛋白的插入,增強(qiáng)GPX活性,提高了突變體vse2清除H2O2能力,增加突變體對(duì)硒的耐受性。2、TPS22介導(dǎo)的硒耐受部分依賴GSH途徑。3、突變體TPSS基因的下調(diào),引起異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和萜類合酶相關(guān)基因的表達(dá)水平增強(qiáng),使細(xì)胞分裂素含量上升,提高了突變體的抗逆能力。另外,TPS22基因下調(diào),使得突變體vse2對(duì)干旱、低溫、滲透脅迫敏感。
【關(guān)鍵詞】：擬南芥 硒耐受性 TPS22基因
【學(xué)位授予單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 致謝7-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-16
• 第一章 前言16-25
• 1.1 模式植物擬南芥16
• 1.2 正向遺傳學(xué)途徑與化學(xué)誘導(dǎo)激活XVE系統(tǒng)16-17
• 1.3 Tail-PCR克隆技術(shù)17
• 1.4 萜類合成酶與異戊烯基轉(zhuǎn)移酶17-19
• 1.4.1 萜類合成酶17-18
• 1.4.2 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶18-19
• 1.5 植物硒研究進(jìn)展19-23
• 1.5.1 硒對(duì)植物的作用19-21
• 1.5.2 植物對(duì)硒的吸收21
• 1.5.3 植物對(duì)硒的運(yùn)輸、代謝途徑21-22
• 1.5.4 植物對(duì)硒耐受的機(jī)理22-23
• 1.6 植物抗干旱、低溫和滲透脅迫的研究進(jìn)展23-24
• 1.6.1 植物抗干旱脅迫研究進(jìn)展23
• 1.6.2 植物抗低溫脅迫研究進(jìn)展23
• 1.6.3 植物抗?jié)B透脅迫研究進(jìn)展23-24
• 1.7 本研究目的和意義24-25
• 第二章 材料與方法25-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25
• 2.2 生化試劑及藥品25-28
• 2.2.1 常用分子生物學(xué)試劑盒25
• 2.2.2 常用生化試劑25
• 2.2.3 常用溶液與試劑的配制方法和用量25-28
• 2.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備28
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法28-43
• 2.4.1 擬南芥的土壤培養(yǎng)28-29
• 2.4.2 擬南芥的培養(yǎng)皿培養(yǎng)29
• 2.4.3 根長(zhǎng)與鮮重的測(cè)量29
• 2.4.4 擬南芥組織中Se含量測(cè)定29-30
• 2.4.5 擬南芥組織中GPX活性測(cè)定30
• 2.4.6 谷胱甘肽(GSH)含量的測(cè)定30-31
• 2.4.7 細(xì)胞分裂素含量的測(cè)定31-32
• 2.4.8 擬南芥DNA的提取(CTAB)方法32-33
• 2.4.9 Tail-PCR法克隆擬南芥耐硒基因33-36
• 2.4.10 Trizol法抽提擬南芥總RNA36
• 2.4.11 RT-PCR和QRT-PCR36-38
• 2.4.12 PCR引物設(shè)計(jì)38-39
• 2.4.13 擬南芥的雜交39-40
• 2.4.14 脯氨酸含量測(cè)定40-41
• 2.4.15 可溶性糖含量測(cè)定41-42
• 2.4.16 丙二醛含量測(cè)定42
• 2.4.17 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析與處理42-43
• 第三章 結(jié)果與分析43-64
• 3.1 耐硒突變體vse2的分離43-46
• 3.1.1 突變體vse2的分離43-44
• 3.1.2 土壤培養(yǎng)條件下的WT和突變體vse244-45
• 3.1.3 突變體vse2發(fā)芽率分析45-46
• 3.2 VSE2基因克隆46-48
• 3.2.1 Tail-PCR法克隆VSE2基因46-47
• 3.2.2 VSE2基因序列47
• 3.2.3 XVE載體插入位點(diǎn)分析47-48
• 3.3 TPS22基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)模式分析48-51
• 3.3.1 TPS22基因表達(dá)水平分析48-49
• 3.3.2 TPS22基因同源性分析和氨基酸序列比對(duì)49-51
• 3.3.4 基因表達(dá)模式分析51
• 3.4 TPS22基因調(diào)控硒耐受的機(jī)理分析51-57
• 3.4.1 突變體vse2的硒吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝分析51-54
• 3.4.3 TPS22基因調(diào)控的硒耐受部分依賴GSH途徑54-56
• 3.4.4 TPS22基因與細(xì)胞分裂素56-57
• 3.5 突變體vse2對(duì)其他脅迫的響應(yīng)57-64
• 3.5.1 突變體vse2對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)57-60
• 3.5.2 突變體vse2對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)60-61
• 3.5.3 突變體vse2對(duì)甘露醇脅迫的響應(yīng)61-64
• 第四章 討論與展望64-66
• 參考文獻(xiàn)66-74
• 攻讀碩士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)活動(dòng)及成果情況74

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