本文關(guān)鍵詞：巴斯德畢赤酵母gup1基因（PpGUP1）在甘油和甲醇代謝中的功能研究

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【摘要】：巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)是目前應(yīng)用最廣泛的外源蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)之一,該系統(tǒng)基于一個(gè)高效的醇氧化酶1(alcohol oxidase 1,AOX1)啟動(dòng)子(AOX1promoter,PAOX1),PAOX1的轉(zhuǎn)錄只響應(yīng)甲醇的誘導(dǎo),當(dāng)以甲醇為唯一碳源時(shí),PAOX1啟動(dòng)外源蛋白的表達(dá),當(dāng)甘油存在時(shí),甘油阻遏aox1的轉(zhuǎn)錄。本文分析了畢赤酵母gup1基因(PpGUP1,基因編號(hào):238029505)在代謝甘油和甲醇中的作用,通過基因敲除、異源表達(dá)和基因過表達(dá),構(gòu)建了不同突變體,在不同碳源培養(yǎng)基培養(yǎng),生物量、碳源代謝速率分析,并從轉(zhuǎn)錄水平分析不同碳源培養(yǎng)基中基因的特異性表達(dá),以期探究甘油抑制PAOX1的分子機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:(1)同源重組構(gòu)建PpGUP1缺陷型菌株GUP1Δ和過表達(dá)菌株分別在BMGY、BMMGY培養(yǎng)基培養(yǎng),甘油利用缺陷型粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe,S.pombe)中異源表達(dá)PpGUP1后在以甘油為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)。生物量及上清甘油含量對(duì)比分析,GUP1Δ與P.pastoris生物量及甘油代謝水平無顯著性差異,PpGUP1過表達(dá)后生物量提高5%,甘油平均代謝速率提高8%,S.pombe中異源表達(dá)PpGUP1基因后不能恢復(fù)對(duì)甘油的利用,通過SDS敏感性實(shí)驗(yàn)分析,GUP1Δ細(xì)胞透性增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,畢赤酵母PpGUP1不是甘油轉(zhuǎn)運(yùn)體,其通過提高細(xì)胞透性間接提高甘油吸收速率。(2)在BMMY培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),GUP1Δ較P.pastoris生物量降低約30%,甲醇代謝水平顯著降低。SDS-PAGE,Western blot檢測AOX1蛋白表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)GUP1Δ菌株AOX1蛋白的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)水平顯著差于P.pastoris菌株,同時(shí)酶活低約50%,PpGUP1過表達(dá)后生物量提高6%,AOX1酶活提高10%。進(jìn)一步分析在不同碳源培養(yǎng)過程中g(shù)up1、mxr1和aox1基因的轉(zhuǎn)錄水平,敲除PpGUP1后,aox1的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低,同時(shí)檢測mxr1的轉(zhuǎn)錄水平下降50%左右,但弱于aox1。PpGUP1在野生菌中過表達(dá)后,mxr1和aox1的轉(zhuǎn)錄水平均有一定提高。PpGUP1缺失抑制甲醇代謝,推測PpGUP1有兩種可能對(duì)aox1的調(diào)節(jié):一是PpGUP1直接調(diào)控aox1的轉(zhuǎn)錄;另一種是PpGUP1通過調(diào)控mxr1的轉(zhuǎn)錄間接調(diào)控aox1,這種調(diào)控更為嚴(yán)謹(jǐn)。
【關(guān)鍵詞】：畢赤酵母 PpGUP1 甘油代謝 甲醇代謝 AOX1 基因轉(zhuǎn)錄
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 緒論7-15
• 1.1 酵母表達(dá)系統(tǒng)簡介7-11
• 1.1.1 酵母表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展7
• 1.1.2 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)7-8
• 1.1.3 PAOX1的調(diào)控機(jī)理研究8-11
• 1.2 碳源阻遏11
• 1.3 甘油轉(zhuǎn)運(yùn)體研究進(jìn)展11-13
• 1.4 gup1和gup2研究現(xiàn)狀13
• 1.5 本課題的目的和意義13-14
• 1.6 本課題的研究內(nèi)容14-15
• 第二章 材料與方法15-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑15-19
• 2.1.1 菌株質(zhì)粒15
• 2.1.2 工具酶和分子量標(biāo)準(zhǔn)15-16
• 2.1.3 主要試劑、耗材及試劑盒16
• 2.1.4 主要儀器及配件16-17
• 2.1.5 主要溶液17-18
• 2.1.6 主要培養(yǎng)基18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-33
• 2.2.1 PpGUP1缺陷型菌株（GUP1Δ）的構(gòu)建20-24
• 2.2.2 PpGUP1過表達(dá)菌株（P. pastoris/pGAPZB+PpGUP1）和缺陷型回補(bǔ)菌株（GUP1Δ/pGAPZB+PpGUP1）的構(gòu)建24-26
• 2.2.3 PpGUP1異源表達(dá)菌株的構(gòu)建26-27
• 2.2.4 突變體生長曲線的測定27-28
• 2.2.5 甘油及甲醇含量的檢測28
• 2.2.6 AOX1蛋白的表達(dá)水平及活性檢測28-30
• 2.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測基因mRNA表達(dá)水平30-33
• 第三章 結(jié)果與討論33-51
• 3.1 突變體菌株的構(gòu)建33-39
• 3.1.1 PpGUP1缺陷型菌株的構(gòu)建33-37
• 3.1.2 PpGUP1過表達(dá)菌株的構(gòu)建37-38
• 3.1.3 PpGUP1異源表達(dá)38-39
• 3.1.4 小結(jié)39
• 3.2 畢赤酵母生長特性39-43
• 3.2.1 生物量分析39-40
• 3.2.2 甘油利用能力40-42
• 3.2.3 缺陷型菌株對(duì)SDS的敏感性42-43
• 3.2.4 小結(jié)43
• 3.3 PpGUP1在AOX1啟動(dòng)子碳源代謝中的作用43-48
• 3.3.1 PpGUP1的敲除抑制細(xì)胞代謝甲醇43-44
• 3.3.2 AOX1表達(dá)酶活的定量測定44-45
• 3.3.3 AOX1蛋白的SDS、Western bloting檢測45-48
• 3.3.4 小結(jié)48
• 3.4 PpGUP1在aox1表達(dá)差異影響發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平48-51
• 主要結(jié)論與展望51-53
• 主要結(jié)論51
• 展望51-53
• 致謝53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 附錄: 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文59

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本文編號(hào)：920223