發(fā)布時間：2017-09-25 09:31

  本文關(guān)鍵詞：甘草NCED4基因植物表達(dá)載體構(gòu)建方法及β-AS基因多態(tài)性研究

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【摘要】：甘草是我國常用的大宗藥材,具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效,被廣泛應(yīng)用于臨床配方。甘草酸是甘草的主要藥效成分,其含量是我國《藥典》規(guī)定的重要指標(biāo)之一。大量研究表明,近年來栽培甘草普遍甘草酸含量較低,達(dá)不到《藥典》標(biāo)準(zhǔn),嚴(yán)重制約甘草資源的可持續(xù)發(fā)展和利用。因此,如何提高甘草中甘草酸含量是保證甘草質(zhì)量的關(guān)鍵問題。已有研究表明,甘草酸生物合成途徑不是孤立存在的,它與其他次生代謝產(chǎn)物如脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、細(xì)胞分裂素(6-BA)、甘草苷(Liquiritin)、甘草素(Liquiritigenin)等生物合成途徑相互連接并構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn),外源噴施適當(dāng)濃度的ABA能夠提高甘草中甘草酸的含量,但其作用機(jī)制尚未可知。9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-Cis-Epoxycarotenoid Dioxygenase,NCED)基因是ABA合成途徑中的限速酶基因之一,其表達(dá)量直接影響ABA的合成。因此,根據(jù)甘草酸生物合成網(wǎng)絡(luò)我們推測,NCED基因表達(dá)量的差異會導(dǎo)致脫落酸含量的差異,進(jìn)而可能影響甘草酸生物合成途徑中關(guān)鍵酶的活性,最終調(diào)控甘草酸的合成量。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將目的基因插入到植物外植體的基因組中,并使其在后代植株的特定組織中穩(wěn)定的表達(dá)。利用該技術(shù),我們可以考察目的基因在植物體內(nèi)的過表達(dá)情況,進(jìn)而分析該基因的表達(dá)量差異對次生代謝產(chǎn)物生物合成的影響機(jī)制。本論文采用轉(zhuǎn)基因技術(shù),嘗試用3種方法——基因融合法、多片段一步克隆法以及根特異性通用表達(dá)載體法來構(gòu)建攜帶甘草NCED4基因的根特異性植物雙源表達(dá)載體,并將該基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,最后培育NCED4基因過表達(dá)的再生植株。本論文為進(jìn)一步研究NCED4基因表達(dá)量對甘草酸生物合成的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ),目前取得的主要成果如下：(1)成功采用多片段一步克隆法構(gòu)建了攜帶甘草NCED4基因的根特異性表達(dá)載體pCA-TobRB7-NCED4-2,并成功轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌EHA105中,完成了工程菌EHA-TobRB7-NCED4-2的構(gòu)建。(2)成功構(gòu)建了根特異性通用表達(dá)載體pCA-TobRB7并保存。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了攜帶甘草NCED4基因的根特異性表達(dá)載體pCA-TobRB7-NCED4-3,并成功轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌EHA105中,完成了工程菌EHA-TobRB7-NCED4-3的構(gòu)建。(3)從載體構(gòu)建準(zhǔn)確率、連接效率以及實驗周期來分析3種載體構(gòu)建方法的優(yōu)劣。從準(zhǔn)確率來看,基因融合法經(jīng)多次重復(fù)實驗仍出現(xiàn)連入片段不完全的現(xiàn)象,準(zhǔn)確率低,因此該種用于方法暫不能用于構(gòu)建攜帶甘草NCED4基因的表達(dá)載體；而多片段一步克隆法和根特異性通用表達(dá)載體法的準(zhǔn)確率均較高,測序結(jié)果表明,連入目的基因片段完整、順序正確。從連接效率來看,經(jīng)多片段一步克隆法構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后,陽性率僅為50%,效率較低；經(jīng)根特異性通用表達(dá)載體法構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后,陽性率為90%,效率較高。從實驗周期長短來看,多片段一步克隆法僅需一次即可完成多片段基因重組,實驗周期最短；而根特異性通用表達(dá)載體法需要分兩次完成,第一次完成通用載體的構(gòu)建,第二次才能將目的基因連入,但在通用載體構(gòu)建成功后可將其保存,今后如需構(gòu)建其他根特異性表達(dá)載體,在TobRB7啟動子序列后選擇其他合適酶切位點將目的基因連入即可,從長遠(yuǎn)來看,根特異性通用表達(dá)載體法更為方便快捷、省時省力。綜上所述,我們認(rèn)為根特異性通用表達(dá)載體法準(zhǔn)確率高、連接效率高、實驗周期較短并且應(yīng)用范圍廣,是最適用于構(gòu)建攜帶甘草NCED4基因的表達(dá)載體構(gòu)建方法；多片段一步克隆法更適用于任何2個以上片段的快速定向克隆,但效率稍低,需嚴(yán)格掌握重組體系中各片段的加入比例。(4)成功通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將含有甘草NCED4基因的工程菌轉(zhuǎn)入甘草下胚軸。之后轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行根特異性過表達(dá)NCED4基因的愈傷組織培養(yǎng)。甘草是中醫(yī)臨床中使用頻率最高的藥材之一,享有“十藥九甘草”之美譽(yù)。近年來,栽培甘草已成為甘草藥材市場的主流商品,但栽培甘草的甘草酸含量普遍偏低,達(dá)不到藥典標(biāo)準(zhǔn),是制約甘草可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。進(jìn)行優(yōu)良品種選育是提高甘草酸含量的有效途徑。發(fā)掘與高甘草酸形成相關(guān)的分子標(biāo)記是進(jìn)行優(yōu)良種質(zhì)資源選育的重要基礎(chǔ),對甘草的分子育種具有重要意義。本文以甘草酸生物合成途徑下游中的關(guān)鍵酶基因——13-香樹脂醇合成酶(β-AS)基因作為研究對象,采用PCR-測序的方法對其內(nèi)含子部分多態(tài)性進(jìn)行檢測,并嘗試分析其內(nèi)含子多態(tài)性與甘草酸含量的相關(guān)性,從而篩選出與高甘草酸含量相關(guān)的分子標(biāo)記,為甘草的分子育種奠定基礎(chǔ)。本論文的主要成果如下：(1)發(fā)現(xiàn)β-AS基因第2內(nèi)含子506 bp、512 bp,第6內(nèi)含子1710bp-1717bp、1744 bp、1745 bp,第8內(nèi)含子2187 bp-2198bp、2216 bp存在變異位點。變異位點類型如下：①單核苷酸多態(tài)性(SNPs):甘草β-AS基因內(nèi)含子共有3處SNPs,在1742 bp處存在T-C顛換,1743 bp存在T-C顛換,2216 bp存在T-G顛換。②等位基因雜合多態(tài)性：甘草β-AS基因內(nèi)含子共有3處等位基因雜合多態(tài)性位點,在506bp處存在C/G雜合,512bp處存在C/G雜合,2216 bp處存在T/G雜合。③插入／缺失突變(Tndels):甘草β-AS基因全長共有2處Indels,在1710bp-1016 bp存在AT缺失,在2187bp-2198bp處存在ATATTGACTTAA共12個堿基的缺失。④拷貝數(shù)多態(tài)性(CNVs):甘草β-AS基因可能存在2個以上拷貝。對164個甘草樣本β-As基因內(nèi)含子進(jìn)行多態(tài)性檢測,除去等位基因雜合多態(tài)性和拷貝數(shù)多態(tài)性的樣本后,共有138個純合型樣本。(2)運用灰色關(guān)聯(lián)法分析各變異位點與甘草酸含量的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)1710bp、1712 bp、1714 bp、2187 bp、2189 bp、2193 bp、2197 bp、2198bp位點的堿基類型與甘草酸含量呈顯著相關(guān)(r0.65)。依據(jù)以上8個高關(guān)聯(lián)變異位點將138個純合型樣本劃分B1-B5共5種類型,其中B5(1710bpA、1712 bp A、1714 bp A、2187 bp A、2189 bp A、2193 bpA、2197 bp A、2198 bp A)型樣本甘草酸含量最高。對138個純合型樣本的甘草酸含量進(jìn)行聚類分析,按照甘草酸含量由低到高排序為Ⅰ組(0.54%-0.92%)、Ⅱ組(0.97%-1.26%)、Ⅲ組(1.29%-2.46%)、Ⅳ組(2.54%-3.33%),其中,B5(1710bp A、 1712bp A、1714bpA、2187bpA、2189bpA、2193bpA、2197bpA、2198bp A)型樣本在4個組之間所占比例存在顯著性差異(PB5=0.0020.05),且B5型在甘草酸含量最高組(Ⅳ組)中所占比例最高(66.67%)。綜上所述,B5為與高甘草酸含量相關(guān)的分子標(biāo)記。(3)分析了甘草各單倍型與甘草酸含量的相關(guān)性。138個純合型樣本可被分為G1-G7共7種單倍型。其中,G7(1710-1715 bp ATATAT,1744-1745 bp TC,2187～2198 bp ATATTGACTTAA,2216 bp G)型樣本甘草酸含量最高。對不同單倍型在4個甘草酸含量積累組中所占比例進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),G7 (1710-1715 bp ATATAT,1744-1745 bp TC, 2187～2198 bp ATATTGACTTAA,2216 bp G)型樣本甘草酸含量在4個組之間所占比例存在顯著性差異(PG7=0.0010.05),且G7型在甘草酸含量最高組(Ⅳ組)中所占比例最高(66.67%)。綜上所述,G7為高甘草酸含量相關(guān)的單倍型類型。(4)綜合分析β-AS基因變異位點及單倍型與甘草酸含量相關(guān)性,我們發(fā)現(xiàn)G7單倍型在1710bp、1712bp、1714bp、2187bp、2189bp、2193bp、2197bp的堿基類型均為A,這與B5這一分子標(biāo)記類型完全相同,由此我們可以得出一致性的結(jié)論,即B5為與高甘草酸含量相關(guān)的分子標(biāo)記,G7為高甘草酸含量相關(guān)的單倍型類型。該分子標(biāo)記所在的第6-第8內(nèi)含子可作為候選檢測區(qū)域,用于篩選品質(zhì)優(yōu)良的甘草種質(zhì)資源。
【關(guān)鍵詞】：甘草 甘草酸 根特異性過表達(dá) NCED4基因 脫落酸 β-AS 分子標(biāo)記 甘草 甘草酸 基因多態(tài)性 內(nèi)含子
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S567.71
【目錄】：

• 第一部分 甘草NCED4基因植物表達(dá)載體構(gòu)建方法研究8-66
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 符號說明13
• 前言13-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述及本論文研究思路15-23
• 1 文獻(xiàn)綜述15-20
• 1.1 脫落酸生物合成途徑及NCED基因家族研究進(jìn)展15-17
• 1.2 表達(dá)載體構(gòu)建方法研究進(jìn)展17-20
• 2 研究思路與方法20-23
• 2.1 研究目標(biāo)20
• 2.2 研究內(nèi)容20-22
• 2.3 技術(shù)路線22-23
• 第二章 煙草TobRB7啟動子的克隆23-29
• 1 實驗材料、試劑及儀器23
• 1.1 植物材料、菌株及質(zhì)粒23
• 1.2 試劑23
• 1.3 儀器與耗材23
• 2 實驗方法23-26
• 2.1 總DNA的提取23-24
• 2.2 PCR擴(kuò)增24-25
• 2.3 膠回收純化25
• 2.4 與克隆載體連接25-26
• 2.5 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞及陽性克隆篩選26
• 2.6 序列分析26
• 3 實驗結(jié)果26-28
• 4 小結(jié)與討論28-29
• 4.1 小結(jié)28
• 4.2 討論28-29
• 第三章 基因融合法表達(dá)載體的構(gòu)建29-40
• 1 實驗材料、試劑及儀器29
• 1.1 菌株及質(zhì)粒29
• 1.2 試劑29
• 1.3 儀器與耗材29
• 2 實驗方法29-34
• 2.1 載體構(gòu)建原理29-30
• 2.2 引物設(shè)計30-31
• 2.3 質(zhì)粒提取31
• 2.4 帶酶切位點及連接位點的基因片段克隆31-32
• 2.5 載體pCAMBIA1305.1雙酶切32
• 2.6 基因融合32-33
• 2.7 基因重組33-34
• 2.8 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化34
• 2.9 陽性克隆的篩選及PCR驗證34
• 2.10 測序及測序結(jié)果分析34
• 3 實驗結(jié)果34-38
• 3.1 帶酶切位點及連接位點的基因片段的克隆結(jié)果34-35
• 3.2 載體pCAMBIA1305.1雙酶切結(jié)果35
• 3.3 基因融合結(jié)果35-36
• 3.4 重組載體陽性克隆篩選結(jié)果36-37
• 3.5 基因重組結(jié)果37-38
• 4 小結(jié)與討論38-40
• 4.1 小結(jié)38
• 4.2 討論38-40
• 第四章 多片段一步克隆法表達(dá)載體的構(gòu)建40-44
• 1 實驗材料、試劑及儀器40
• 2 實驗方法40
• 3 實驗結(jié)果40-42
• 3.1 重組載體陽性克隆篩選結(jié)果40-41
• 3.2 基因重組結(jié)果41-42
• 4 小結(jié)與討論42-44
• 4.1 小結(jié)42-43
• 4.2 討論43-44
• 第五章 根特異性通用表達(dá)載體的構(gòu)建44-50
• 1 實驗材料、試劑及儀器44
• 2 實驗方法44-46
• 2.1 載體構(gòu)建原理44
• 2.2 質(zhì)粒提取44
• 2.3 引物設(shè)計44-45
• 2.4 帶酶切位點及連接位點的基因片段克隆45
• 2.5 載體pCAMBIA1305.1雙酶切45-46
• 2.6 根特異性通用表達(dá)載體pCA-TobRB7的雙酶切46
• 3 實驗結(jié)果46-48
• 3.1 pCA-TobRB7根特異性通用表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果46-47
• 3.2 pCA-TobRB7-NCED4-3根特異性通用表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果47-48
• 4 小結(jié)與討論48-50
• 4.1 小結(jié)48-49
• 4.2 討論49-50
• 第六章 甘草根特異性表達(dá)工程菌的構(gòu)建50-52
• 1 實驗材料、試劑及儀器50
• 1.1 菌株及質(zhì)粒50
• 1.2 試劑50
• 1.3 儀器與耗材50
• 2 實驗方法50-51
• 2.1 根特異性重組質(zhì)粒的提取50
• 2.2 根特異性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌50
• 2.3 陽性克隆的篩選及測序50-51
• 3 實驗結(jié)果51
• 4 小結(jié)51-52
• 第七章 根特異性過表達(dá)NCED4基因甘草愈傷組織的培養(yǎng)52-59
• 1 實驗材料、試劑及儀器52
• 1.1 實驗材料52
• 1.2 試劑、儀器、耗材52
• 2. 培養(yǎng)基及溶液配制52-54
• 2.1 6,7V培養(yǎng)基配方52-54
• 2.2 其他試劑及母液54
• 3. 實驗方法54-55
• 3.1 根癌農(nóng)桿菌工程菌的活化54
• 3.2 甘草外植體材料的制備54-55
• 3.3 侵染、共培養(yǎng)、除菌及愈傷組織的誘導(dǎo)55
• 4. 實驗結(jié)果55-58
• 4.1 根癌農(nóng)桿菌工程菌的活化55
• 4.2 甘草外植體材料的制備55-56
• 4.3 侵染、共培養(yǎng)及除菌56-58
• 5. 小結(jié)與討論58-59
• 5.1 小結(jié)58
• 5.2 討論58-59
• 第八章 總結(jié)和展望59-62
• 1 總結(jié)59-60
• 2 展望60-62
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 第二部分：基于甘草β-AS基因內(nèi)含子多態(tài)性的高甘草酸含量分子標(biāo)記研究66-121
• 摘要66-68
• ABSTRACT68-70
• 符號說明70
• 前言70-72
• 第九章 文獻(xiàn)綜述及本論文研究思路72-81
• 1. 文獻(xiàn)綜述72-79
• 1.1 分子標(biāo)記與藥用植物有效成分含量的相關(guān)性研究進(jìn)展72-75
• 1.2 甘草中甘草酸含量差異現(xiàn)狀的研究進(jìn)展75-77
• 1.3 甘草酸生物合成途徑及β-AS基因多態(tài)性研究進(jìn)展77-79
• 2. 研究思路與方法79-81
• 2.1 研究目標(biāo)79
• 2.2 研究內(nèi)容79
• 2.3 研究方案79-80
• 2.4 技術(shù)路線80-81
• 第十章 甘草β-AS基因內(nèi)含子多態(tài)性的檢測及分析81-89
• 1 實驗材料、試劑及儀器81-82
• 1.1 植物材料81
• 1.2 試劑81
• 1.3 儀器和耗材81-82
• 2 實驗方法82-84
• 2.1 總DNA提取82
• 2.2 甘草β-AS基因內(nèi)含子分片段引物設(shè)計82-83
• 2.3 PCR反應(yīng)體系83
• 2.4 PCR反應(yīng)條件83-84
• 2.5 序列校對拼接84
• 2.6 甘草β-AS基因內(nèi)含子多態(tài)性分析84
• 3 實驗結(jié)果84-87
• 3.1 甘草β-AS基因內(nèi)含子片段的PCR結(jié)果84-85
• 3.2 β-AS基因內(nèi)含子測序及BLAST結(jié)果85-87
• 3.3 甘草β-AS基因內(nèi)含子多態(tài)性分析87
• 4 小結(jié)與討論87-89
• 4.1 小結(jié)87
• 4.2 討論87-89
• 第十一章 甘草β-AS基因內(nèi)含子與高甘草酸含量相關(guān)的分子標(biāo)記研究89-113
• 1 實驗材料、試劑及儀器89
• 1.1 植物材料89
• 1.2 試劑89
• 1.3 儀器和耗材89
• 2 實驗方法89-91
• 2.1 甘草樣本甘草酸HPLC法含量測定89-90
• 2.2 甘草β-AS基因各變異位點與甘草酸含量的關(guān)聯(lián)分析90
• 2.3 甘草β-AS基因單倍型與甘草酸含量的相關(guān)性分析90-91
• 3 實驗結(jié)果91-110
• 3.1 甘草酸含量測定結(jié)果91-100
• 3.2 甘草β-AS基因各變異位點與甘草酸含量的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果100-106
• 3.3 甘草β-AS基因單倍型與甘草酸含量的相關(guān)性分析結(jié)果106-110
• 4 小結(jié)與討論110-113
• 4.1 小結(jié)110-112
• 4.2 討論112-113
• 第十二章 總結(jié)和展望113-116
• 1 總結(jié)113-114
• 2 展望114-116
• 參考文獻(xiàn)116-121
• 致謝121-123
• 個人簡歷123-124

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 臧藝玫;李妍們;喬晶;陳宏昊;劉春生;;基于β-香樹脂醇合成酶基因SNP的甘草道地性機(jī)制研究[J];藥學(xué)學(xué)報;2015年07期

2 田亞然;薛t熿，

本文編號：916682