本文關鍵詞：甘草NCED4基因植物表達載體構建方法及β-AS基因多態(tài)性研究

  更多相關文章： 甘草 甘草酸 根特異性過表達 NCED4基因 脫落酸 β-AS 分子標記 甘草 甘草酸 基因多態(tài)性 內含子

【摘要】：甘草是我國常用的大宗藥材,具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥等功效,被廣泛應用于臨床配方。甘草酸是甘草的主要藥效成分,其含量是我國《藥典》規(guī)定的重要指標之一。大量研究表明,近年來栽培甘草普遍甘草酸含量較低,達不到《藥典》標準,嚴重制約甘草資源的可持續(xù)發(fā)展和利用。因此,如何提高甘草中甘草酸含量是保證甘草質量的關鍵問題。已有研究表明,甘草酸生物合成途徑不是孤立存在的,它與其他次生代謝產物如脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、細胞分裂素(6-BA)、甘草苷(Liquiritin)、甘草素(Liquiritigenin)等生物合成途徑相互連接并構成網絡。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn),外源噴施適當濃度的ABA能夠提高甘草中甘草酸的含量,但其作用機制尚未可知。9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-Cis-Epoxycarotenoid Dioxygenase,NCED)基因是ABA合成途徑中的限速酶基因之一,其表達量直接影響ABA的合成。因此,根據甘草酸生物合成網絡我們推測,NCED基因表達量的差異會導致脫落酸含量的差異,進而可能影響甘草酸生物合成途徑中關鍵酶的活性,最終調控甘草酸的合成量。轉基因技術是將目的基因插入到植物外植體的基因組中,并使其在后代植株的特定組織中穩(wěn)定的表達。利用該技術,我們可以考察目的基因在植物體內的過表達情況,進而分析該基因的表達量差異對次生代謝產物生物合成的影響機制。本論文采用轉基因技術,嘗試用3種方法——基因融合法、多片段一步克隆法以及根特異性通用表達載體法來構建攜帶甘草NCED4基因的根特異性植物雙源表達載體,并將該基因進行遺傳轉化,最后培育NCED4基因過表達的再生植株。本論文為進一步研究NCED4基因表達量對甘草酸生物合成的調控機制奠定了基礎,目前取得的主要成果如下：(1)成功采用多片段一步克隆法構建了攜帶甘草NCED4基因的根特異性表達載體pCA-TobRB7-NCED4-2,并成功轉入到根癌農桿菌EHA105中,完成了工程菌EHA-TobRB7-NCED4-2的構建。(2)成功構建了根特異性通用表達載體pCA-TobRB7并保存。在此基礎上,構建了攜帶甘草NCED4基因的根特異性表達載體pCA-TobRB7-NCED4-3,并成功轉入到根癌農桿菌EHA105中,完成了工程菌EHA-TobRB7-NCED4-3的構建。(3)從載體構建準確率、連接效率以及實驗周期來分析3種載體構建方法的優(yōu)劣。從準確率來看,基因融合法經多次重復實驗仍出現(xiàn)連入片段不完全的現(xiàn)象,準確率低,因此該種用于方法暫不能用于構建攜帶甘草NCED4基因的表達載體；而多片段一步克隆法和根特異性通用表達載體法的準確率均較高,測序結果表明,連入目的基因片段完整、順序正確。從連接效率來看,經多片段一步克隆法構建的表達載體轉化感受態(tài)細胞后,陽性率僅為50%,效率較低；經根特異性通用表達載體法構建的載體轉化感受態(tài)細胞后,陽性率為90%,效率較高。從實驗周期長短來看,多片段一步克隆法僅需一次即可完成多片段基因重組,實驗周期最短；而根特異性通用表達載體法需要分兩次完成,第一次完成通用載體的構建,第二次才能將目的基因連入,但在通用載體構建成功后可將其保存,今后如需構建其他根特異性表達載體,在TobRB7啟動子序列后選擇其他合適酶切位點將目的基因連入即可,從長遠來看,根特異性通用表達載體法更為方便快捷、省時省力。綜上所述,我們認為根特異性通用表達載體法準確率高、連接效率高、實驗周期較短并且應用范圍廣,是最適用于構建攜帶甘草NCED4基因的表達載體構建方法；多片段一步克隆法更適用于任何2個以上片段的快速定向克隆,但效率稍低,需嚴格掌握重組體系中各片段的加入比例。(4)成功通過根癌農桿菌介導法,將含有甘草NCED4基因的工程菌轉入甘草下胚軸。之后轉入誘導培養(yǎng)基進行根特異性過表達NCED4基因的愈傷組織培養(yǎng)。甘草是中醫(yī)臨床中使用頻率最高的藥材之一,享有“十藥九甘草”之美譽。近年來,栽培甘草已成為甘草藥材市場的主流商品,但栽培甘草的甘草酸含量普遍偏低,達不到藥典標準,是制約甘草可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。進行優(yōu)良品種選育是提高甘草酸含量的有效途徑。發(fā)掘與高甘草酸形成相關的分子標記是進行優(yōu)良種質資源選育的重要基礎,對甘草的分子育種具有重要意義。本文以甘草酸生物合成途徑下游中的關鍵酶基因——13-香樹脂醇合成酶(β-AS)基因作為研究對象,采用PCR-測序的方法對其內含子部分多態(tài)性進行檢測,并嘗試分析其內含子多態(tài)性與甘草酸含量的相關性,從而篩選出與高甘草酸含量相關的分子標記,為甘草的分子育種奠定基礎。本論文的主要成果如下：(1)發(fā)現(xiàn)β-AS基因第2內含子506 bp、512 bp,第6內含子1710bp-1717bp、1744 bp、1745 bp,第8內含子2187 bp-2198bp、2216 bp存在變異位點。變異位點類型如下：①單核苷酸多態(tài)性(SNPs):甘草β-AS基因內含子共有3處SNPs,在1742 bp處存在T-C顛換,1743 bp存在T-C顛換,2216 bp存在T-G顛換。②等位基因雜合多態(tài)性：甘草β-AS基因內含子共有3處等位基因雜合多態(tài)性位點,在506bp處存在C/G雜合,512bp處存在C/G雜合,2216 bp處存在T/G雜合。③插入／缺失突變(Tndels):甘草β-AS基因全長共有2處Indels,在1710bp-1016 bp存在AT缺失,在2187bp-2198bp處存在ATATTGACTTAA共12個堿基的缺失。④拷貝數多態(tài)性(CNVs):甘草β-AS基因可能存在2個以上拷貝。對164個甘草樣本β-As基因內含子進行多態(tài)性檢測,除去等位基因雜合多態(tài)性和拷貝數多態(tài)性的樣本后,共有138個純合型樣本。(2)運用灰色關聯(lián)法分析各變異位點與甘草酸含量的相關性,發(fā)現(xiàn)1710bp、1712 bp、1714 bp、2187 bp、2189 bp、2193 bp、2197 bp、2198bp位點的堿基類型與甘草酸含量呈顯著相關(r0.65)。依據以上8個高關聯(lián)變異位點將138個純合型樣本劃分B1-B5共5種類型,其中B5(1710bpA、1712 bp A、1714 bp A、2187 bp A、2189 bp A、2193 bpA、2197 bp A、2198 bp A)型樣本甘草酸含量最高。對138個純合型樣本的甘草酸含量進行聚類分析,按照甘草酸含量由低到高排序為Ⅰ組(0.54%-0.92%)、Ⅱ組(0.97%-1.26%)、Ⅲ組(1.29%-2.46%)、Ⅳ組(2.54%-3.33%),其中,B5(1710bp A、 1712bp A、1714bpA、2187bpA、2189bpA、2193bpA、2197bpA、2198bp A)型樣本在4個組之間所占比例存在顯著性差異(PB5=0.0020.05),且B5型在甘草酸含量最高組(Ⅳ組)中所占比例最高(66.67%)。綜上所述,B5為與高甘草酸含量相關的分子標記。(3)分析了甘草各單倍型與甘草酸含量的相關性。138個純合型樣本可被分為G1-G7共7種單倍型。其中,G7(1710-1715 bp ATATAT,1744-1745 bp TC,2187～2198 bp ATATTGACTTAA,2216 bp G)型樣本甘草酸含量最高。對不同單倍型在4個甘草酸含量積累組中所占比例進行分析后發(fā)現(xiàn),G7 (1710-1715 bp ATATAT,1744-1745 bp TC, 2187～2198 bp ATATTGACTTAA,2216 bp G)型樣本甘草酸含量在4個組之間所占比例存在顯著性差異(PG7=0.0010.05),且G7型在甘草酸含量最高組(Ⅳ組)中所占比例最高(66.67%)。綜上所述,G7為高甘草酸含量相關的單倍型類型。(4)綜合分析β-AS基因變異位點及單倍型與甘草酸含量相關性,我們發(fā)現(xiàn)G7單倍型在1710bp、1712bp、1714bp、2187bp、2189bp、2193bp、2197bp的堿基類型均為A,這與B5這一分子標記類型完全相同,由此我們可以得出一致性的結論,即B5為與高甘草酸含量相關的分子標記,G7為高甘草酸含量相關的單倍型類型。該分子標記所在的第6-第8內含子可作為候選檢測區(qū)域,用于篩選品質優(yōu)良的甘草種質資源。
【關鍵詞】：甘草 甘草酸 根特異性過表達 NCED4基因 脫落酸 β-AS 分子標記 甘草 甘草酸 基因多態(tài)性 內含子
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S567.71
【目錄】：

• 第一部分 甘草NCED4基因植物表達載體構建方法研究8-66
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 符號說明13
• 前言13-15
• 第一章 文獻綜述及本論文研究思路15-23
• 1 文獻綜述15-20
• 1.1 脫落酸生物合成途徑及NCED基因家族研究進展15-17
• 1.2 表達載體構建方法研究進展17-20
• 2 研究思路與方法20-23
• 2.1 研究目標20
• 2.2 研究內容20-22
• 2.3 技術路線22-23
• 第二章 煙草TobRB7啟動子的克隆23-29
• 1 實驗材料、試劑及儀器23
• 1.1 植物材料、菌株及質粒23
• 1.2 試劑23
• 1.3 儀器與耗材23
• 2 實驗方法23-26
• 2.1 總DNA的提取23-24
• 2.2 PCR擴增24-25
• 2.3 膠回收純化25
• 2.4 與克隆載體連接25-26
• 2.5 轉化感受態(tài)細胞及陽性克隆篩選26
• 2.6 序列分析26
• 3 實驗結果26-28
• 4 小結與討論28-29
• 4.1 小結28
• 4.2 討論28-29
• 第三章 基因融合法表達載體的構建29-40
• 1 實驗材料、試劑及儀器29
• 1.1 菌株及質粒29
• 1.2 試劑29
• 1.3 儀器與耗材29
• 2 實驗方法29-34
• 2.1 載體構建原理29-30
• 2.2 引物設計30-31
• 2.3 質粒提取31
• 2.4 帶酶切位點及連接位點的基因片段克隆31-32
• 2.5 載體pCAMBIA1305.1雙酶切32
• 2.6 基因融合32-33
• 2.7 基因重組33-34
• 2.8 重組質粒的轉化34
• 2.9 陽性克隆的篩選及PCR驗證34
• 2.10 測序及測序結果分析34
• 3 實驗結果34-38
• 3.1 帶酶切位點及連接位點的基因片段的克隆結果34-35
• 3.2 載體pCAMBIA1305.1雙酶切結果35
• 3.3 基因融合結果35-36
• 3.4 重組載體陽性克隆篩選結果36-37
• 3.5 基因重組結果37-38
• 4 小結與討論38-40
• 4.1 小結38
• 4.2 討論38-40
• 第四章 多片段一步克隆法表達載體的構建40-44
• 1 實驗材料、試劑及儀器40
• 2 實驗方法40
• 3 實驗結果40-42
• 3.1 重組載體陽性克隆篩選結果40-41
• 3.2 基因重組結果41-42
• 4 小結與討論42-44
• 4.1 小結42-43
• 4.2 討論43-44
• 第五章 根特異性通用表達載體的構建44-50
• 1 實驗材料、試劑及儀器44
• 2 實驗方法44-46
• 2.1 載體構建原理44
• 2.2 質粒提取44
• 2.3 引物設計44-45
• 2.4 帶酶切位點及連接位點的基因片段克隆45
• 2.5 載體pCAMBIA1305.1雙酶切45-46
• 2.6 根特異性通用表達載體pCA-TobRB7的雙酶切46
• 3 實驗結果46-48
• 3.1 pCA-TobRB7根特異性通用表達載體的構建結果46-47
• 3.2 pCA-TobRB7-NCED4-3根特異性通用表達載體的構建結果47-48
• 4 小結與討論48-50
• 4.1 小結48-49
• 4.2 討論49-50
• 第六章 甘草根特異性表達工程菌的構建50-52
• 1 實驗材料、試劑及儀器50
• 1.1 菌株及質粒50
• 1.2 試劑50
• 1.3 儀器與耗材50
• 2 實驗方法50-51
• 2.1 根特異性重組質粒的提取50
• 2.2 根特異性重組質粒轉化農桿菌50
• 2.3 陽性克隆的篩選及測序50-51
• 3 實驗結果51
• 4 小結51-52
• 第七章 根特異性過表達NCED4基因甘草愈傷組織的培養(yǎng)52-59
• 1 實驗材料、試劑及儀器52
• 1.1 實驗材料52
• 1.2 試劑、儀器、耗材52
• 2. 培養(yǎng)基及溶液配制52-54
• 2.1 6,7V培養(yǎng)基配方52-54
• 2.2 其他試劑及母液54
• 3. 實驗方法54-55
• 3.1 根癌農桿菌工程菌的活化54
• 3.2 甘草外植體材料的制備54-55
• 3.3 侵染、共培養(yǎng)、除菌及愈傷組織的誘導55
• 4. 實驗結果55-58
• 4.1 根癌農桿菌工程菌的活化55
• 4.2 甘草外植體材料的制備55-56
• 4.3 侵染、共培養(yǎng)及除菌56-58
• 5. 小結與討論58-59
• 5.1 小結58
• 5.2 討論58-59
• 第八章 總結和展望59-62
• 1 總結59-60
• 2 展望60-62
• 參考文獻62-66
• 第二部分：基于甘草β-AS基因內含子多態(tài)性的高甘草酸含量分子標記研究66-121
• 摘要66-68
• ABSTRACT68-70
• 符號說明70
• 前言70-72
• 第九章 文獻綜述及本論文研究思路72-81
• 1. 文獻綜述72-79
• 1.1 分子標記與藥用植物有效成分含量的相關性研究進展72-75
• 1.2 甘草中甘草酸含量差異現(xiàn)狀的研究進展75-77
• 1.3 甘草酸生物合成途徑及β-AS基因多態(tài)性研究進展77-79
• 2. 研究思路與方法79-81
• 2.1 研究目標79
• 2.2 研究內容79
• 2.3 研究方案79-80
• 2.4 技術路線80-81
• 第十章 甘草β-AS基因內含子多態(tài)性的檢測及分析81-89
• 1 實驗材料、試劑及儀器81-82
• 1.1 植物材料81
• 1.2 試劑81
• 1.3 儀器和耗材81-82
• 2 實驗方法82-84
• 2.1 總DNA提取82
• 2.2 甘草β-AS基因內含子分片段引物設計82-83
• 2.3 PCR反應體系83
• 2.4 PCR反應條件83-84
• 2.5 序列校對拼接84
• 2.6 甘草β-AS基因內含子多態(tài)性分析84
• 3 實驗結果84-87
• 3.1 甘草β-AS基因內含子片段的PCR結果84-85
• 3.2 β-AS基因內含子測序及BLAST結果85-87
• 3.3 甘草β-AS基因內含子多態(tài)性分析87
• 4 小結與討論87-89
• 4.1 小結87
• 4.2 討論87-89
• 第十一章 甘草β-AS基因內含子與高甘草酸含量相關的分子標記研究89-113
• 1 實驗材料、試劑及儀器89
• 1.1 植物材料89
• 1.2 試劑89
• 1.3 儀器和耗材89
• 2 實驗方法89-91
• 2.1 甘草樣本甘草酸HPLC法含量測定89-90
• 2.2 甘草β-AS基因各變異位點與甘草酸含量的關聯(lián)分析90
• 2.3 甘草β-AS基因單倍型與甘草酸含量的相關性分析90-91
• 3 實驗結果91-110
• 3.1 甘草酸含量測定結果91-100
• 3.2 甘草β-AS基因各變異位點與甘草酸含量的關聯(lián)分析結果100-106
• 3.3 甘草β-AS基因單倍型與甘草酸含量的相關性分析結果106-110
• 4 小結與討論110-113
• 4.1 小結110-112
• 4.2 討論112-113
• 第十二章 總結和展望113-116
• 1 總結113-114
• 2 展望114-116
• 參考文獻116-121
• 致謝121-123
• 個人簡歷123-124

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 臧藝玫;李妍們;喬晶;陳宏昊;劉春生;;基于β-香樹脂醇合成酶基因SNP的甘草道地性機制研究[J];藥學學報;2015年07期

2 田亞然;薛t熿，

本文編號：916682