本文關鍵詞：PIK3CA和AKT3基因多態(tài)性與家兔生長速度關聯(lián)分析及對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響

  更多相關文章： PIK3CA基因 AKT3基因 SNP SCs 生長

【摘要】：3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase,P13K)家族是眾多原癌基因中極重要的一員,參與多種信號通路,調節(jié)細胞的主要生理功能。由P13K與AKT組成的P13K-AKT信號通路在細胞的增殖以及凋亡等過程中發(fā)揮至關重要的作用。本試驗采用PCR產物直接測序法尋找PIK3CA和AKT3基因的遺傳變異,應用PCR-RFLP技術對歐洲大白兔、伊拉兔D系和福建黑兔3個肉兔品種共711個個體進行基因型分析,探討家兔PIK3CA和AKT3基因的多態(tài)性及其與家兔生長速度的相關性。隨后選取出生后1d的新西蘭仔兔為實驗材料,進行分離、純化家兔骨骼肌衛(wèi)星細胞(Skeletal muscle satellite cells,S Cs),并采用siRNA介導的PIK3CA和AKT3基因進行基因的沉默表達,研究其在家兔SCs增殖過程中發(fā)揮的作用。主要結果如下：1.通過PCR產物直接測序,在PIK3CA基因序列上共找到6個SNPs位點,分別為：g.12178AG、g.12388CT、g.12605TC、g.12711CG、c.3068AG和c-3377GC。其中c.3068AG為同義突變,位于外顯子20。對該位點采用PCR-RFLP的技術進行基因分型并進行關聯(lián)性分析。、結果發(fā)現(xiàn)：c.3068AG位點在歐洲大白和福建黑兔群體中,AG基因型個體的35、56和70日齡體重均顯著高于GG基因型個體(P0.05),在伊拉兔D系群體中AG基因型個體35-70日齡的平均日增重則極顯著高于GG基因型個體(P0.01)。2.AKT3基因序列上檢測到2個SNPs位點,分別為：c.1213AC和g.258389TC。其中c.1213AC為同義突變,位于外顯子10。關聯(lián)性分析表明：c.1213AC位點在歐洲大白兔群體中,A.A基因型個體的35、56和70日齡體重均顯著高于CC基因型個體(P0.05)3.針對PIK3CA和AKT3基因,分別采用三對特異的siRNA序列轉染SCs,然后qRT-PCR法檢測在濃度分別為25nM.50nM.75nM和100nM情況下,轉染組和對照組中PIK3CA和AKT3基因mRNA的相對表達量。結果發(fā)現(xiàn)使用50nM的si-PIK3CA-003和50nM的si-AKT3-001對細胞內靶基因的mRNA表達水平均有理想的下調作用,對靶基因的抑制效率分別為85.16%和83.93%。4.對處于對數(shù)生長期的細胞轉染si-PIK3CA-003或si-AKT3-001 48h后,分別對靶基因和上下游基因PTEN和FoxO1進行qRT-PCR反應。結果表明：在轉染si-PIK3CA-003后,PIK3CA和AKT3基因的相對表達量均顯著下調,PTEN和Foxo1基因的表達量均顯著上調;當轉染了si-AKT3-001后,PTEN和Fox01基因表達量均顯著上調。表明PTEN、FoxO1基因與PIK3cA、AKT3基因的相對表達量呈負相關。5.選取處于對數(shù)期的SCs進行轉染實驗,采用CCK-8試劑盒通過酶標儀檢測其在轉染si-PIK3CA-003或si-AKT3-001后細胞增殖能力的改變。結果發(fā)現(xiàn)：轉染實驗組OD值顯著低于空白對照組(P0.05),說明通過轉染實驗下調PIK3CA和AKT3基因表達后,細胞增殖能力均有顯著的下降。說明PIK3CA和AKT3在SCs的增殖過程中起到重要的作用,能夠正向調控肌細胞的增殖。家兔PIK3CA和AKT3基因CDS區(qū)的SNPs與生長速度相關,PIK3CA和AKT3基因可作為影響家兔生長速度的重要候選基因,為采用分子育種提高家兔生產性能提供理論依據。通過對PIK3CA和AKT3基因抑制表達,發(fā)現(xiàn)PIK3CA和AKT3基因能夠正向調控肌細胞的增殖,初步探討了PIK3CA和AKT3基因在家兔骨骼肌發(fā)育過程中的作用。
【關鍵詞】：PIK3CA基因 AKT3基因 SNP SCs 生長
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S829.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文獻綜述10-20
• 1.1 概述10
• 1.2 動物骨骼肌生長發(fā)育10-11
• 1.3 骨骼肌衛(wèi)星細胞11-13
• 1.3.1 骨骼肌衛(wèi)星細胞簡介11-12
• 1.3.2 骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離方法12-13
• 1.3.3 骨骼肌衛(wèi)星細胞鑒定13
• 1.4 PI3K-AKT信號通路及相關基因13-17
• 1.4.1 AKT家族14
• 1.4.2 PI3K家族14
• 1.4.3 PI3K-AKT信號通路的功能14-16
• 1.4.4 與PI3K-AKT信號通路相關的上下游基因16-17
• 1.5 RNAi技術的應用17-19
• 1.5.1 RNAi技術的發(fā)現(xiàn)17-18
• 1.5.2 RNAi的作用機制18-19
• 1.6 本研究的目的與意義及主要試驗內容19-20
• 1.6.1 本試驗的目的與意義19-20
• 1.6.2 本試驗的主要內容20
• 2 材料與方法20-35
• 2.1 試驗動物選擇與組織采集20-21
• 2.2 主要設備及器材21
• 2.2.1 分子實驗主要設備儀器21
• 2.2.2 細胞培養(yǎng)主要設備和器材21
• 2.3 主要試劑及配制21-22
• 2.4 試驗方法22-35
• 2.4.1 耳組織基因組DNA提取22-23
• 2.4.2 DNA濃度及純度檢測23-24
• 2.4.3 PIK3CA、AKT3基因變異位點檢測24-25
• 2.4.4 PIK3CA和AKT3基因靶SNPs位點與生長速度關聯(lián)性分析25-26
• 2.4.5 新西蘭兔SCs分離、純化及培養(yǎng)26
• 2.4.6 SCs的鑒定26-27
• 2.4.7 SCs的傳代、凍存和復蘇27-28
• 2.4.8 誘導分化和HE染色28-29
• 2.4.9 CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖29
• 2.4.10 siRNA合成及轉染細胞29-31
• 2.4.11 熒光定量PCR反應檢測siRNA對靶基因的抑制效果31-34
• 2.4.12 數(shù)據處理34-35
• 3 結果與分析35-47
• 3.1 基因組DNA提取結果35
• 3.2 PIK3CA和AKT3基因突變位點的檢測和遺傳多樣性分析35-38
• 3.2.1 PIK3CA和AKT3基因突變位點的檢測35-36
• 3.2.2 利用PCR-RFLP對突變位點進行基因分型36-37
• 3.2.3 PIK3CA和AKT3基因遺傳多樣性分析37-38
• 3.3 家兔PIK3CA和AKT3基因SNP位點不同基因型與生長速度的相關性38-40
• 3.4 兔SCs的鑒定40-42
• 3.4.1 SCs的形態(tài)學觀察40-42
• 3.4.2 家兔SCs的免疫組化染色鑒定42
• 3.5 免疫熒光鑒定siRNA轉染效率42-43
• 3.6 細胞總RNA提取結果43
• 3.7 篩選下調目的基因表達水平的si-PIK3CA和si-AKT343-44
• 3.8 篩選最佳轉染濃度44-45
• 3.9 轉染siRNA對SCs細胞增殖的影響45-46
• 3.9.1 SCs生長曲線繪制45-46
• 3.9.2 轉染siRNA后SCs的增殖能力檢測結果46
• 3.10 轉染siRNA后上下游相關基因的相對表達量46-47
• 4 討論47-52
• 4.1 PIK3CA和AKT3基因多態(tài)性與家兔生長速度相關47-49
• 4.1.1 c.3068A>G位點與家兔生長速度相關性47-48
• 4.1.2 c.1213A>C位點與家兔生長速度相關性48-49
• 4.2 成功分離、純化兔SCs細胞49-50
• 4.3 轉染si-PIK3CA-003或si-AKT3-001對上下游基因表達量的影響50-51
• 4.4 PIK3CA、AKT3基因對細胞增殖的影響51
• 4.5 PIK3CA、AKT3基因對家兔骨骼肌發(fā)育的作用51-52
• 5 結論52-53
• 參考文獻53-59
• 致謝59-60
• 攻讀學位期間完成的學術成果60

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前10條

1 王雪鵬;李茂強;邊振宇;季成;何齊芳;姚旺祥;朱六龍;;PI3K/Akt信號通路在骨髓間充質干細胞增殖及成骨分化調控中的作用[J];中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志;2014年03期

2 王玉霞;趙陽;鄧霖;遲希明;索琳娜;紀紅梅;;遼寧地區(qū)漢族人群中FoxO1基因rs17446614多態(tài)性與2型糖尿病的相關性[J];中國生物制品學雜志;2014年08期

3 劉蘇健;范波;丁明超;王意忠;王斌;;靶向Akt1基因RNA干擾對胸主動脈平滑肌細胞增殖的影響[J];河北醫(yī)藥;2014年18期

4 潘學華;陳文川;;伊拉兔與新西蘭、加利福尼亞、比利時肉兔對比試驗報告[J];畜禽業(yè);2014年08期

5 王軼敏;代陽;劉新峰;劉中偉;李吉霞;郭宏;丁向彬;;牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離鑒定和誘導分化[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年07期

6 譚千洪;王永康;沈代福;;伊拉兔引種在重慶地區(qū)的生產性能測定與推廣效益分析[J];湖北畜牧獸醫(yī);2014年05期

7 李伯江;李平華;吳望軍;李齊發(fā);黃瑞華;劉紅林;;骨骼肌肌纖維形成機制的研究進展[J];中國農業(yè)科學;2014年06期

8 史新娥;吳國芳;宋子儀;路宏朝;賈龍;朱嘉宇;楊公社;;阻斷PI3K/AKT通路通過激活FoxO1抑制豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化[J];中國農業(yè)科學;2014年01期

9 趙紅霞;;PTEN與腫瘤的相關性研究進展[J];武漢大學學報(醫(yī)學版);2014年01期

10 黃瑩瑩;;流式細胞分選術的應用進展[J];科技視界;2013年03期

中國重要會議論文全文數(shù)據庫 前2條

1 李明勇;宋大偉;;歐洲伊拉肉兔配套系和養(yǎng)殖技術在中國的實踐[A];中國畜牧獸醫(yī)學會養(yǎng)兔學分會成立大會暨第一屆學術交流大會論文集[C];2015年

2 蘇冠華;劉啟云;盧永昕;米少華;孫雨霏;劉曉明;帥欣欣;;犬骨骼肌成肌細胞體外分離、純化及培養(yǎng)方法改良探索[A];中華醫(yī)學會第11次心血管病學術會議論文摘要集[C];2009年

中國博士學位論文全文數(shù)據庫 前2條

1 呂艷蓉;抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶鑒定及PTEN泛素化調控乳腺癌細胞凋亡的研究[D];山東大學;2014年

2 熊兵紅;MiR-21通過PTEN/PI3K/AKT信號通路調控結直腸癌侵襲轉移的機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據庫 前2條

1 高巖;PI3K、Akt1、Akt2、NFκB在2型糖尿病骨質疏松大鼠腎組織中表達[D];河北醫(yī)科大學;2012年

2 李粉;miR-23在小鼠骨骼肌中的表達及其對骨骼肌再生調節(jié)作用的初步研究[D];南京師范大學;2011年

，

本文編號：908726