發(fā)布時(shí)間：2017-09-24 02:06

  本文關(guān)鍵詞：PIK3CA和AKT3基因多態(tài)性與家兔生長(zhǎng)速度關(guān)聯(lián)分析及對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響

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【摘要】：3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase,P13K)家族是眾多原癌基因中極重要的一員,參與多種信號(hào)通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞的主要生理功能。由P13K與AKT組成的P13K-AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖以及凋亡等過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本試驗(yàn)采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法尋找PIK3CA和AKT3基因的遺傳變異,應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)歐洲大白兔、伊拉兔D系和福建黑兔3個(gè)肉兔品種共711個(gè)個(gè)體進(jìn)行基因型分析,探討家兔PIK3CA和AKT3基因的多態(tài)性及其與家兔生長(zhǎng)速度的相關(guān)性。隨后選取出生后1d的新西蘭仔兔為實(shí)驗(yàn)材料,進(jìn)行分離、純化家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(Skeletal muscle satellite cells,S Cs),并采用siRNA介導(dǎo)的PIK3CA和AKT3基因進(jìn)行基因的沉默表達(dá),研究其在家兔SCs增殖過(guò)程中發(fā)揮的作用。主要結(jié)果如下：1.通過(guò)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序,在PIK3CA基因序列上共找到6個(gè)SNPs位點(diǎn),分別為：g.12178AG、g.12388CT、g.12605TC、g.12711CG、c.3068AG和c-3377GC。其中c.3068AG為同義突變,位于外顯子20。對(duì)該位點(diǎn)采用PCR-RFLP的技術(shù)進(jìn)行基因分型并進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。、結(jié)果發(fā)現(xiàn)：c.3068AG位點(diǎn)在歐洲大白和福建黑兔群體中,AG基因型個(gè)體的35、56和70日齡體重均顯著高于GG基因型個(gè)體(P0.05),在伊拉兔D系群體中AG基因型個(gè)體35-70日齡的平均日增重則極顯著高于GG基因型個(gè)體(P0.01)。2.AKT3基因序列上檢測(cè)到2個(gè)SNPs位點(diǎn),分別為：c.1213AC和g.258389TC。其中c.1213AC為同義突變,位于外顯子10。關(guān)聯(lián)性分析表明：c.1213AC位點(diǎn)在歐洲大白兔群體中,A.A基因型個(gè)體的35、56和70日齡體重均顯著高于CC基因型個(gè)體(P0.05)3.針對(duì)PIK3CA和AKT3基因,分別采用三對(duì)特異的siRNA序列轉(zhuǎn)染SCs,然后qRT-PCR法檢測(cè)在濃度分別為25nM.50nM.75nM和100nM情況下,轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組中PIK3CA和AKT3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用50nM的si-PIK3CA-003和50nM的si-AKT3-001對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶基因的mRNA表達(dá)水平均有理想的下調(diào)作用,對(duì)靶基因的抑制效率分別為85.16%和83.93%。4.對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-PIK3CA-003或si-AKT3-001 48h后,分別對(duì)靶基因和上下游基因PTEN和FoxO1進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)染si-PIK3CA-003后,PIK3CA和AKT3基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào),PTEN和Foxo1基因的表達(dá)量均顯著上調(diào);當(dāng)轉(zhuǎn)染了si-AKT3-001后,PTEN和Fox01基因表達(dá)量均顯著上調(diào)。表明PTEN、FoxO1基因與PIK3cA、AKT3基因的相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。5.選取處于對(duì)數(shù)期的SCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),采用CCK-8試劑盒通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)其在轉(zhuǎn)染si-PIK3CA-003或si-AKT3-001后細(xì)胞增殖能力的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組OD值顯著低于空白對(duì)照組(P0.05),說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)下調(diào)PIK3CA和AKT3基因表達(dá)后,細(xì)胞增殖能力均有顯著的下降。說(shuō)明PIK3CA和AKT3在SCs的增殖過(guò)程中起到重要的作用,能夠正向調(diào)控肌細(xì)胞的增殖。家兔PIK3CA和AKT3基因CDS區(qū)的SNPs與生長(zhǎng)速度相關(guān),PIK3CA和AKT3基因可作為影響家兔生長(zhǎng)速度的重要候選基因,為采用分子育種提高家兔生產(chǎn)性能提供理論依據(jù)。通過(guò)對(duì)PIK3CA和AKT3基因抑制表達(dá),發(fā)現(xiàn)PIK3CA和AKT3基因能夠正向調(diào)控肌細(xì)胞的增殖,初步探討了PIK3CA和AKT3基因在家兔骨骼肌發(fā)育過(guò)程中的作用。
【關(guān)鍵詞】：PIK3CA基因 AKT3基因 SNP SCs 生長(zhǎng)
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S829.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文獻(xiàn)綜述10-20
• 1.1 概述10
• 1.2 動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育10-11
• 1.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞11-13
• 1.3.1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞簡(jiǎn)介11-12
• 1.3.2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離方法12-13
• 1.3.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞鑒定13
• 1.4 PI3K-AKT信號(hào)通路及相關(guān)基因13-17
• 1.4.1 AKT家族14
• 1.4.2 PI3K家族14
• 1.4.3 PI3K-AKT信號(hào)通路的功能14-16
• 1.4.4 與PI3K-AKT信號(hào)通路相關(guān)的上下游基因16-17
• 1.5 RNAi技術(shù)的應(yīng)用17-19
• 1.5.1 RNAi技術(shù)的發(fā)現(xiàn)17-18
• 1.5.2 RNAi的作用機(jī)制18-19
• 1.6 本研究的目的與意義及主要試驗(yàn)內(nèi)容19-20
• 1.6.1 本試驗(yàn)的目的與意義19-20
• 1.6.2 本試驗(yàn)的主要內(nèi)容20
• 2 材料與方法20-35
• 2.1 試驗(yàn)動(dòng)物選擇與組織采集20-21
• 2.2 主要設(shè)備及器材21
• 2.2.1 分子實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備儀器21
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)主要設(shè)備和器材21
• 2.3 主要試劑及配制21-22
• 2.4 試驗(yàn)方法22-35
• 2.4.1 耳組織基因組DNA提取22-23
• 2.4.2 DNA濃度及純度檢測(cè)23-24
• 2.4.3 PIK3CA、AKT3基因變異位點(diǎn)檢測(cè)24-25
• 2.4.4 PIK3CA和AKT3基因靶SNPs位點(diǎn)與生長(zhǎng)速度關(guān)聯(lián)性分析25-26
• 2.4.5 新西蘭兔SCs分離、純化及培養(yǎng)26
• 2.4.6 SCs的鑒定26-27
• 2.4.7 SCs的傳代、凍存和復(fù)蘇27-28
• 2.4.8 誘導(dǎo)分化和HE染色28-29
• 2.4.9 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖29
• 2.4.10 siRNA合成及轉(zhuǎn)染細(xì)胞29-31
• 2.4.11 熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)siRNA對(duì)靶基因的抑制效果31-34
• 2.4.12 數(shù)據(jù)處理34-35
• 3 結(jié)果與分析35-47
• 3.1 基因組DNA提取結(jié)果35
• 3.2 PIK3CA和AKT3基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)和遺傳多樣性分析35-38
• 3.2.1 PIK3CA和AKT3基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)35-36
• 3.2.2 利用PCR-RFLP對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行基因分型36-37
• 3.2.3 PIK3CA和AKT3基因遺傳多樣性分析37-38
• 3.3 家兔PIK3CA和AKT3基因SNP位點(diǎn)不同基因型與生長(zhǎng)速度的相關(guān)性38-40
• 3.4 兔SCs的鑒定40-42
• 3.4.1 SCs的形態(tài)學(xué)觀察40-42
• 3.4.2 家兔SCs的免疫組化染色鑒定42
• 3.5 免疫熒光鑒定siRNA轉(zhuǎn)染效率42-43
• 3.6 細(xì)胞總RNA提取結(jié)果43
• 3.7 篩選下調(diào)目的基因表達(dá)水平的si-PIK3CA和si-AKT343-44
• 3.8 篩選最佳轉(zhuǎn)染濃度44-45
• 3.9 轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)SCs細(xì)胞增殖的影響45-46
• 3.9.1 SCs生長(zhǎng)曲線繪制45-46
• 3.9.2 轉(zhuǎn)染siRNA后SCs的增殖能力檢測(cè)結(jié)果46
• 3.10 轉(zhuǎn)染siRNA后上下游相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量46-47
• 4 討論47-52
• 4.1 PIK3CA和AKT3基因多態(tài)性與家兔生長(zhǎng)速度相關(guān)47-49
• 4.1.1 c.3068A>G位點(diǎn)與家兔生長(zhǎng)速度相關(guān)性47-48
• 4.1.2 c.1213A>C位點(diǎn)與家兔生長(zhǎng)速度相關(guān)性48-49
• 4.2 成功分離、純化兔SCs細(xì)胞49-50
• 4.3 轉(zhuǎn)染si-PIK3CA-003或si-AKT3-001對(duì)上下游基因表達(dá)量的影響50-51
• 4.4 PIK3CA、AKT3基因?qū)?xì)胞增殖的影響51
• 4.5 PIK3CA、AKT3基因?qū)彝霉趋兰“l(fā)育的作用51-52
• 5 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 致謝59-60
• 攻讀學(xué)位期間完成的學(xué)術(shù)成果60

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：908726