本文關鍵詞：表達ω-3脂肪酸去飽和酶基因的轉基因雞的研究

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【摘要】：目的:ω-3脂肪酸脫氫酶(Fat-1基因)能夠催化ω-6 PUFAs生成ω-3 PUFAs,后者中的EPA和DHA對胎兒的大腦和視神經(jīng)發(fā)育起著至關重要的作用,同時在治療老年癡呆癥、心腦血管疾病、癌癥以及精神疾病等方面有著一定的效果,而ω-6 PUFAs卻與癌癥的發(fā)生關聯(lián)密切。人體內Fat-1基因的缺乏以及飲食中ω-3 PUFAs分布不均勻,導致體內ω-6 PUFAs嚴重堆積,使得ω-6/ω-3的比值遠遠超過1:1的理想狀態(tài),因此必須通過合理膳食來補充人體對ω-3 PUFAs的需求。植物中含有的α亞麻酸可以合成EPA和DHA,但合成效率極低,人類也可以通過攝食海產(chǎn)品來獲得ω-3PUFAs,但這樣一來成本過高,二來也容易在體內積累海洋污染物質。本研究的目的,就是通過對來源于秀麗線蟲的Fat-1基因進行改造,使其能夠在雞體細胞內高效表達,同時有效地將ω-6轉化為ω-3,優(yōu)化ω-6/ω-3比例,在此基礎上,利用轉基因技術獲得肉中富含ω-3 PUFAs的轉基因雞。方法:1.Fat-1基因密碼子的優(yōu)化、表達載體構建以及轉基因活性分析胰酶消化法獲得雞胚胎成纖維細胞;根據(jù)雞密碼子使用頻率,對秀麗隱桿線蟲Fat-1基因序列進行優(yōu)化合成;將改造后的Fat-1基因(c Fat-1)連接至p LL3.7表達載體,構建重組質粒p LL3.7-c Fat-1;經(jīng)PCR、酶切、序列分析等手段對重組載體進行鑒定;利用Turbo Fect轉染試劑將p LL3.7-c Fat-1轉染體外培養(yǎng)的成纖維細胞;通過對被轉染細胞中目的基因的RT-PCR檢測和綠色熒光觀察,分析c Fat-1基因在細胞中的表達;然后以氣相色譜分析轉染后細胞中的脂肪酸成分和含量。2.轉基因雞的生成(1)胚盤下腔顯微注射法:于新鮮未孵化種蛋的赤道最高處開口,暴露胚盤,胚盤中央明區(qū)注射2μL重組質粒,保鮮膜封口,常規(guī)條件孵化;(2)外周血管顯微注射法:將孵化至13~15期的雞胚移入新的備用蛋殼,胚胎血管中注射外源質粒,保鮮膜封口后小角度翻蛋孵化。收集不同孵化時期的胚胎,提取組織DNA、RNA以及脂肪酸,隨后進行冰凍切片檢測;再對陽性個體的組織進行PCR、RT-PCR以及氣相色譜檢測分析。結果:重組載體經(jīng)序列比對,發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后序列編碼氨基酸與Fat-1基因一致;c Fat-1基因在雞成纖維細胞中高效表達,成功構建了可在雞體內表達c Fat-1基因的特異性表達載體;轉基因細胞系中ω-3 PUFAs的含量從2.33522增升至5.21512,而ω-6 PUFAs減低了1.3倍左右,ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比例從4.7降低到1.7;血管注射法獲得的轉基因雞的肝臟、胸肌、腿肌等組織的冰凍切片中檢測到熒光信號,PCR、RT-PCR結果也證實了外源基因的表達;肌肉脂肪酸分析發(fā)現(xiàn),轉基因陽性個體胸肌組織中ω-3 PUFAs的含量明顯升高,且ω-6 PUFAs與ω-3 PUFAs之比從對照組的5.1下降至2.2。結論:本研究成功構建了適合在雞體內表達的真核表達載體p LL3.7-c Fat-1;轉染p LL3.7-c Fat-1的雞成纖維細胞能高效表達外源基因,并能有效地將ω-6 PUFAs轉化為ω-3 PUFAs;再以顯微注射法產(chǎn)生轉基因陽性個體,色譜分析結果證明轉基因個體能夠表達ω-3脂肪酸脫氫酶,胸肌中ω-6/ω-3的比值顯著下降。
【關鍵詞】：雞 ω-3脂肪酸脫氫酶 基因表達 轉基因
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 英文縮略表12-14
• 引言14-15
• 第一章 文獻綜述15-23
• 1.1 ω-3 多不飽和脂肪酸15-17
• 1.1.1 ω-3 多不飽和脂肪酸概況15-16
• 1.1.2 ω-3 多不飽和脂肪酸的作用16-17
• 1.1.2.1 ω-3 PUFAs參與脂質代謝16
• 1.1.2.2 ω-3 PUFAs參與基因調控16
• 1.1.2.3 ω-3 PUFAs調節(jié)細胞生長16
• 1.1.2.4 ω-3 PUFAs參與免疫調節(jié)16-17
• 1.1.2.5 ω-3 PUFAs的抗疾病作用17
• 1.2 ω-6 /ω-3 PUFAs的平衡17-18
• 1.3 脂肪酸脫氫酶Fat-1 基因的重要性18-19
• 1.3.1 Fat-1 基因及其作用機制18
• 1.3.2 Fat-1 轉基因動物的研究18-19
• 1.4 轉基因技術在品種培育中的應用19-22
• 1.4.1 轉基因動物的產(chǎn)生19-20
• 1.4.2 轉基因方法20-21
• 1.4.3 轉基因技術應用21-22
• 1.5 本課題研究的目的和意義22-23
• 第二章 雞胚胎成纖維細胞的體外培養(yǎng)23-30
• 2.1 試驗材料23-24
• 2.1.1 試驗細胞23
• 2.1.2 主要試劑和儀器設備23-24
• 2.1.2.1 主要試劑23
• 2.1.2.2 主要試劑的配制23
• 2.1.2.3 主要儀器設備23-24
• 2.2 試驗方法24-25
• 2.2.1 雞胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng)24
• 2.2.2 細胞的分離及傳代24
• 2.2.3 細胞的凍存24-25
• 2.2.4 細胞的復蘇25
• 2.3 結果與分析25-28
• 2.3.1 原代細胞的生長狀況及形態(tài)特征25-26
• 2.3.2 傳代細胞的生長情況及形態(tài)特征26-27
• 2.3.3 復蘇細胞的生長狀況及形態(tài)特征27-28
• 2.4 討論28-29
• 2.5 結論29-30
• 第三章 Fat-1 基因密碼子優(yōu)化及高效表達載體的構建30-41
• 3.1 試驗材料30-31
• 3.1.1 宿主菌和載體30
• 3.1.2 主要試劑30
• 3.1.3 常用試劑配置30-31
• 3.1.4 主要試驗儀器31
• 3.2 試驗方法31-34
• 3.2.1 Fat-1 基因的優(yōu)化與人工合成31-32
• 3.2.2 cFat-1 基因的體外擴增和序列分析32-34
• 3.2.3 重組表達載體的構建與鑒定34
• 3.3 結果與分析34-39
• 3.3.1 Fat-1 的優(yōu)化34-35
• 3.3.2 c Fat-1 基因的獲得35-36
• 3.3.3 重組質粒的構建36-37
• 3.3.4 重組表達載體的鑒定37-39
• 3.4 討論39-40
• 3.5 結論40-41
• 第四章c Fat-1 基因在雞成纖維細胞中的表達41-53
• 4.1 試驗材料41-42
• 4.1.1 試驗樣品41
• 4.1.2 主要試劑41
• 4.1.3 試劑配制41
• 4.1.4 主要儀器設備41-42
• 4.2 試驗方法42-46
• 4.2.1 重組載體質粒的大量提取42-43
• 4.2.2 試驗細胞的準備43
• 4.2.3 細胞轉染43
• 4.2.4 陽性克隆的分子鑒定43-45
• 4.2.5 細胞脂肪酸測定45-46
• 4.3 結果分析46-50
• 4.3.1 pLL3.7-cFat-1 在雞胚胎成纖維細胞中的表達46-47
• 4.3.2 轉染細胞外源基因表達的分子鑒定47-48
• 4.3.3 轉染細胞的分子水平鑒定48-50
• 4.4 討論50-52
• 4.5 結論52-53
• 第五章 表達Fat-1 基因的轉基因雞的生成53-70
• 5.1 試驗材料53-54
• 5.1.1 試驗用種蛋53
• 5.1.2 主要試劑及耗材53
• 5.1.3 試劑配制53-54
• 5.1.4 儀器設備54
• 5.2 試驗方法54-59
• 5.2.1 注射針的制備54
• 5.2.2 蛋殼膜及代用蛋殼的的制備54-55
• 5.2.3 待用種蛋的預處理55
• 5.2.4 重組載體的顯微注射55-56
• 5.2.5 注射個體冰凍切片檢測56
• 5.2.6 注射個體各組織PCR檢測56-57
• 5.2.7 注射個體各組織RT-PCR鑒定57-58
• 5.2.8 注射個體的脂肪酸測定58-59
• 5.3 結果與分析59-67
• 5.3.1 胚胎孵化情況統(tǒng)計59-60
• 5.3.2 兩種注射方法的比較60-62
• 5.3.3 重組載體顯微注射后不同組織熒光檢測62-63
• 5.3.4 轉基因個體的組織PCR檢測63-64
• 5.3.5 轉基因個體的RT-PCR檢測64-65
• 5.3.6 轉基因個體脂肪酸測定結果65-67
• 5.4 討論67-69
• 5.5 結論69-70
• 第六章 結論與創(chuàng)新70-71
• 6.1 全文結論70
• 6.2 論文的創(chuàng)新70-71
• 參考文獻71-78
• 致謝78-79
• 作者簡介79-80
• 導師評閱表80

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本文編號：904804