本文關(guān)鍵詞：泛素基因家族在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程中的功能分析

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【摘要】：泛素-蛋白酶體是普遍存在于生物體各組織內(nèi)的蛋白降解通路,它參與了幾乎所有動植物體的生命活動,包括細胞增殖、分化;細胞周期調(diào)控;膜受體內(nèi)吞作用;基因的轉(zhuǎn)錄與表達等方面,它能通過降解其他通路的抑制因子或激活因子從而調(diào)控通路的進程。為了研究該通路在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程中的功能,本研究克隆驗證了28泛素家族基因的開放閱讀框,其中包括1個泛素前體、5個泛素類似物、2個泛素活化酶、14個泛素結(jié)合酶、3個泛素連接酶和3個泛素羧基末端水解酶。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了這28個基因在斑節(jié)對蝦性腺不同發(fā)育時期的卵巢和肝胰腺中的表達,結(jié)果顯示在卵巢發(fā)育中各基因的表達趨勢大體上分為三支,有8個基因的表達總趨勢上升(UBE3S、UBE2N、UBFD1、UBE2G1、UBE2J2、UFM、UFM1、UBE2H1);7個基因的表達總趨勢下降(UMAE5、UBE、UPL、UCHIL5、UBS30、UDCP2、ULP3);10個基因的表達呈先升后降的趨勢(UCH14、UBE2V2、UBE2Q1、UBE2A、UBE2G2、UBA1、UBE2H、UBE3B1F1、UBE2C、UBE2H5b)。各基因在卵巢不同發(fā)育期對應(yīng)的肝胰腺中的表達結(jié)果顯示基因的表達趨勢大體上分為三支,有12個基因的表達總趨勢先降后升(UBE3S、UBE2N、UFM、UBFD1、UBE、UBE2A、UPL、UBE2G1、UBA1、UBE3B1F1);2個基因的表達總趨勢上升(UBE2V2、UBE2H1);14個基因的表達呈先降后升,再降的趨勢(UCH14、UBE2Q1、UBE2G2、UBE2H、UBE2C、UBE2H5b、UMAE5、UCHIL5、UBS30、UDCP2、ULP3、UBE2J2、UFM1、UBE2)。根據(jù)結(jié)果篩選出泛素前體(UBS30)、泛素活化酶E1(UBA1)、泛素結(jié)合酶E2(UBE2A、UBE2G1、UBE2G2和UBE2H)6個基因進行進一步的蛋白功能分析。PmUBS30全長為933 bp,開放閱讀框為396 bp,編碼131個氨基酸;熒光定量PCR結(jié)果顯示該基因在胃中表達量最高,心臟次之;構(gòu)建體外重組表達體系,1mmol/L IPTG、25℃誘導(dǎo)6小時可得到33.5kD左右目的條帶,Western Blot驗證目的條帶后進行蛋白純化,蛋白濃度為3.13μg/μl。PmUBA1全長為3822 bp,開放閱讀框為3120 bp,編碼1039個氨基酸;熒光定量PCR結(jié)果顯示該基因在淋巴器官和胃中表達量最高,鰓次之;構(gòu)建體外重組表達體系1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)6小時可得到其核心區(qū)域約為34kD的目的條帶,Western Blot驗證目的條帶后進行蛋白純化,濃度為3.20μg/μl;利用重組蛋白制備多克隆抗體,免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示UBA1在斑節(jié)對蝦卵巢不同發(fā)育時期中的卵巢中主要定位于細胞質(zhì)中,且在III期、IV期、V期卵巢中表達較為明顯,I期和II期卵巢中無明顯表達。PmUBE2A全長為941 bp,開放閱讀框為498 bp,編碼165個氨基酸;熒光定量PCR結(jié)果顯示該基因在淋巴器官表達量最高,胃組織次之,其次是鰓、心臟;1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)6小時可得到其核心區(qū)域約為38 kD的目的條帶,Western Blot驗證目的條帶后進行蛋白純化,濃度約為2.08μg/μl。PmUBE2G1全長為911 bp,開放閱讀框為501 bp,編碼166個氨基酸;熒光定量結(jié)果顯示該基因在淋巴器官、鰓組織和胃組織中表達量最高,心臟次之;1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)6小時可得到其核心區(qū)域約為38 kD的目的條帶,Western Blot驗證目的條帶。PmUBE2G2得到片段長為620 bp,開放閱讀框為507 bp,編碼168個氨基酸;熒光定量PCR結(jié)果顯示該基因在淋巴器官和胃中表達量最高,肝胰腺次之,與鰓和心臟組織的差異不顯著;1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)6小時可得到其核心區(qū)域約為38kD的目的條帶,Western Blot驗證目的條帶后進行蛋白純化,濃度約為2.66μg/μl。PmUBE2H得到片段長為1010 bp,開放閱讀框為555 bp,編碼184個氨基酸;熒光定量PCR結(jié)果顯示該基因在淋巴器官表達量最高,鰓次之;1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)6小時可得到其核心區(qū)域約為39kD的目的條帶,Western Blot驗證目的條帶后進行蛋白純化,濃度約為2.92μg/μl。本實驗通過研究泛素家族基因在斑節(jié)對蝦性腺不同發(fā)育時期的卵巢和肝胰腺中的表達,推斷這些基因分別參與斑節(jié)對蝦卵巢卵母細胞分化及卵黃蛋白積累,同時參與肝胰腺卵黃蛋白原的合成及轉(zhuǎn)運。并篩選6個各類基因進行進一步的蛋白功能研究,為進一步研究泛素基因家族在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育中的調(diào)控機制提供參考。
【關(guān)鍵詞】：斑節(jié)對蝦 卵巢發(fā)育 泛素家族 熒光定量
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• abstract5-8
• 英文縮略詞表8-12
• 1 前言12-18
• 1.1 泛素家族基因研究進展12-15
• 1.1.1 泛素家族基因研究12-14
• 1.1.2 泛素家族在性腺發(fā)育中的研究14-15
• 1.2 斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的研究15-16
• 1.3 本研究的目的意義16-17
• 1.4 本研究的主要技術(shù)路線17-18
• 2 材料與方法18-30
• 2.1 材料18-20
• 2.1.1 斑節(jié)對蝦樣品制備18
• 2.1.2 主要試劑及儀器18-20
• 2.2 方法20-30
• 2.2.1 卵巢切片制作20
• 2.2.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄20-21
• 2.2.3 泛素家族基因的篩選和驗證21-24
• 2.2.4 泛素家族基因的全長獲得24
• 2.2.5 泛素家族基因的表達情況24
• 2.2.6 生物信息學(xué)分析24-25
• 2.2.7 原核表達25
• 2.2.8 SDS-PAGE及免疫印跡25-27
• 2.2.9 蛋白純化27-28
• 2.2.10 蛋白濃度測定28-29
• 2.2.11 免疫組化29-30
• 3 結(jié)果30-68
• 3.1 卵巢切片分期30-31
• 3.2 泛素基因家族的篩選與克隆31-33
• 3.2.1 基因的篩選31
• 3.2.2 泛素家族基因克隆31-33
• 3.3 泛素家族基因的表達分析33-35
• 3.3.1 泛素家族基因在斑節(jié)對蝦不同性腺發(fā)育時期卵巢中的表達33-34
• 3.3.2 泛素家族基因在斑節(jié)對蝦不同性腺發(fā)育時期肝胰腺中的表達34-35
• 3.4 泛素基因家族的蛋白功能研究35-68
• 3.4.1 PmUBS30基因的蛋白功能研究35-40
• 3.4.2 PmUBA1基因的蛋白功能研究40-49
• 3.4.3 PmUBE2A基因的蛋白功能研究49-53
• 3.4.4 PmUBE2G1基因的蛋白功能研究53-58
• 3.4.5 PmUBE2G2基因的蛋白功能研究58-62
• 3.4.6 PmUBE2H基因的蛋白功能研究62-68
• 4 討論68-77
• 4.1 泛素基因家族在斑節(jié)對蝦性腺不同發(fā)育時期的卵巢和肝胰腺中的表達分析68-70
• 4.1.1 泛素基因家族在卵巢中的表達分析68-69
• 4.1.2 泛素基因家族在肝胰腺中的表達分析69-70
• 4.2 PmUBS30基因的結(jié)構(gòu)及功能70-71
• 4.3 PmUBA1基因的結(jié)構(gòu)及功能71-72
• 4.4 PmUBE2A基因的結(jié)構(gòu)及功能72-73
• 4.5 PmUBE2G1基因的結(jié)構(gòu)及功能73-74
• 4.6 PmUBE2G2基因的結(jié)構(gòu)及功能74-75
• 4.7 PmUBE2H基因的結(jié)構(gòu)及功能75-77
• 5 結(jié)論77-78
• 致謝78-79
• 參考文獻79-86
• 附錄A 引物序列86-91
• 附錄B 基因序列91-103
• 附錄C 熒光定量PCR結(jié)果103-110

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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8 陳金民;魏華;沈z，

本文編號：890811