本文關(guān)鍵詞：禽流感病毒B類等位基因NS1蛋白的原核表達(dá)、純化及熱穩(wěn)定性分析

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【摘要】：A型流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因(non-structural protein,NS)在進(jìn)化上可以分為等位基因A和B,兩者之間同源性低于70%;NS1是流感病毒對(duì)抗宿主免疫系統(tǒng)的主要毒力因子之一。本研究在序列比對(duì)分析的基礎(chǔ)上,表達(dá)、純化了本實(shí)驗(yàn)室保存的4株B類等位基因禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)(A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8),A/environment/Hunan/S4484/11(H12N7),A/duck/Guangdong/07/00(H5N1)和A/duck/Shanghai/08/01(H5N1))的NS1蛋白,并對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定性分析。首先從感染的雞胚尿囊液中提取病毒總RNA,利用特異引物Uni12反轉(zhuǎn)錄獲得c DNA,以其為模板PCR擴(kuò)增得到NS1全長(zhǎng)片段,利用Bam HⅠ和NotⅠ雙酶切將其定向插入p GEX6P-1載體,大腸桿菌(Escherichia coli)BL21菌株中誘導(dǎo)表達(dá)。該蛋白在純化過(guò)程中穩(wěn)定性差,沉淀析出。為此,進(jìn)一步構(gòu)建NS1蛋白截短突變體(1M-202A,R38A/K41A),并在BL21菌株中誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)過(guò)GE health Glutathione sepharose 4B親和層析、Source Q陽(yáng)離子交換柱層析和Hitrap Superdex75分子篩凝膠層析逐步純化,然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠純度分析,并測(cè)定OD320,進(jìn)行蛋白熱穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明,經(jīng)進(jìn)化分析,4株病毒均屬于禽流感病毒B類等位基因群,4株病毒NS1蛋白經(jīng)過(guò)全長(zhǎng)野生型、全長(zhǎng)突變體及截短突變體的逐步優(yōu)化表達(dá),截短突變體NS1蛋白表達(dá)質(zhì)量相對(duì)較高,最終經(jīng)過(guò)逐步純化獲得純度達(dá)到90%以上的蛋白樣品,且4株病毒中A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8)NS1蛋白的穩(wěn)定性最好。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究其分子結(jié)構(gòu)與功能提供了基礎(chǔ)資料。
【作者單位】： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院;中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： 禽流感病毒 NS蛋白 原核表達(dá)純化 熱穩(wěn)定性
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31402206)
【分類號(hào)】：S852.65
【正文快照】： 禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一種主要流行于禽類的傳染病,具有傳染性強(qiáng)、傳播速度快的特點(diǎn)。一些亞型禽流感病毒,如H5N1、H7N9和H9N2病毒,不僅對(duì)家禽具有致病力,而且嚴(yán)重威脅人類公共衛(wèi)生安全(Li,Chen,2014)。A型流感病毒的基因組

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