本文關(guān)鍵詞：耐旱耐鹽抗除草劑轉(zhuǎn)基因棉花新材料的鑒定

  更多相關(guān)文章： 轉(zhuǎn)基因棉花 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 轉(zhuǎn)錄因子 耐旱性 耐鹽性

【摘要】：棉花屬于重要的經(jīng)濟(jì)作物,但是受土壤干旱和鹽堿化面積日益加大的影響,棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降,給生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大損失。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,運(yùn)用基因工程方法創(chuàng)制耐旱耐鹽堿棉花新材料、新種質(zhì),是目前棉花領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛,最有效的育種途徑。ERF(Ethylene responsive factor)類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的類(lèi)蛋白質(zhì)分子,普遍參與調(diào)控植物對(duì)外界各種脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。為了提高棉花對(duì)干旱和鹽堿的耐受能力,本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將分別從抗旱沙生植物胡楊(Populus euphratica Oliv.)和海水潮汐帶紅樹(shù)林植物秋(Kandelia candel (Linn.) Druce)中分離的PeDREB2a和KcERF轉(zhuǎn)錄因子基因構(gòu)建在含CP4抗性標(biāo)記基因的表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)化棉花,對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行鑒定與分析,獲得了一定數(shù)量的轉(zhuǎn)基因棉花株系,為棉花抗逆性的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)材料。主要結(jié)果如下：(1)通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥,從已構(gòu)建好的5個(gè)表達(dá)載體中篩選出表達(dá)性狀最佳、以rd29A為啟動(dòng)子的雙價(jià)載體：pCAMBIAl302-KcERF-PeDREB2a,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入陸地常規(guī)棉R15,經(jīng)培養(yǎng)基培育、嫁接、定植、溫室培養(yǎng)、PCR分子檢測(cè),最終獲得32株轉(zhuǎn)基因棉花。(2)轉(zhuǎn)基因棉花通過(guò)冬季海南加代、夏季河北繼代,最終獲得T3代轉(zhuǎn)基因棉花株系。(3)對(duì)常規(guī)棉花R15進(jìn)行不同濃度的Kanamycin(Kan)噴施處理,初步確定基其Kan抗性篩選濃度為1500 mg/L,待T3代轉(zhuǎn)基因棉花長(zhǎng)至4～5片真葉時(shí),進(jìn)行Kan噴施,初篩抗性棉株,剔除非抗性棉株。(4)對(duì)T3代初篩抗性棉株進(jìn)行PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR分子檢測(cè),獲得6株轉(zhuǎn)基因棉花,通過(guò)Southern雜交分析得出,外源基因多以單拷貝的方式插入受體細(xì)胞基因組中,轉(zhuǎn)基因植株的遺傳遵循孟德?tīng)栠z傳定律,而且,子代無(wú)基因沉默現(xiàn)象。(5)對(duì)大田T3代轉(zhuǎn)基因棉花、以及對(duì)照組常規(guī)棉R15進(jìn)行草甘膦噴施處理,轉(zhuǎn)基因棉花表現(xiàn)出良好的除草劑抗性,而對(duì)照組幾乎全部死亡,證明抗除草劑基因CP4-epsps專(zhuān)入棉花體內(nèi)并進(jìn)行了表達(dá)。(6)室內(nèi)種植部分轉(zhuǎn)基因棉花株系,對(duì)其進(jìn)行15%PEG6000 和 200mmol/LNaCl處理,觀察表型變化,同時(shí)通過(guò)干旱和鹽脅迫下相關(guān)生理指標(biāo)的分析得出,干旱和高鹽脅迫下,轉(zhuǎn)基因棉花的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)與對(duì)照組,轉(zhuǎn)KcERF-PeDREB基因棉花體內(nèi)的MDA含量顯著低于對(duì)照組,C AT、SOD活性和游離脯氨酸含量均高于對(duì)照組,同時(shí),與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)基因棉花的根系更發(fā)達(dá),種子飽滿(mǎn)度更高。通過(guò)qPCR分析脅迫后棉株KcERF和PeDREB2a基因表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)干旱和鹽脅迫均可誘導(dǎo)外源PeDREB、KcERF基因超表達(dá)。綜上,PeDREB、KcERF基因提高了棉花的耐旱、耐鹽能力。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)基因棉花 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 轉(zhuǎn)錄因子 耐旱性 耐鹽性
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S562
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-21
• 1.1 棉花概述10
• 1.2 棉花耐旱、耐鹽研究進(jìn)展10-16
• 1.2.1 干旱對(duì)植物的影響及脅迫響應(yīng)機(jī)制10-11
• 1.2.2 鹽堿對(duì)植物的影響及脅迫響應(yīng)機(jī)制11-12
• 1.2.3 提高植物耐旱耐鹽的途徑12-13
• 1.2.4 棉花耐旱、耐鹽研究進(jìn)展13-16
• 1.3 抗除草劑棉花研究進(jìn)展16-17
• 1.4 植物抗逆轉(zhuǎn)錄因子概述17-19
• 1.4.1 轉(zhuǎn)錄因子的功能17
• 1.4.2 抗逆轉(zhuǎn)錄因子分類(lèi)及特點(diǎn)17-18
• 1.4.3 ERF/DEEB概述18-19
• 1.5 棉花轉(zhuǎn)基因育種方法19-20
• 1.5.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法19
• 1.5.2 花粉管通道法19
• 1.5.3 基因槍法19-20
• 1.6 研究目的和意義20-21
• 第二章 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因棉花21-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-26
• 2.1.1 棉花材料21
• 2.1.2 基因來(lái)源21
• 2.1.3 引物序列21-22
• 2.1.4 載體和菌種22-23
• 2.1.5 培養(yǎng)基23-25
• 2.1.6 相關(guān)試劑及緩沖液25
• 2.1.7 儀器和設(shè)備25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-30
• 2.2.1 攜帶中間載體的大腸桿菌活化及鑒定26
• 2.2.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)制備26-27
• 2.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化27
• 2.2.4 含目的基因表達(dá)載體鑒定27
• 2.2.5 最優(yōu)表達(dá)載體的篩選27-28
• 2.2.6 遺傳轉(zhuǎn)化28-29
• 2.2.7 陽(yáng)性棉株鑒定29
• 2.2.8 轉(zhuǎn)化幼苗的定植29-30
• 2.2.9 T1代轉(zhuǎn)基因棉花的獲得30
• 2.3 結(jié)果及分析30-36
• 2.3.1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及鑒定30-31
• 2.3.2 最優(yōu)表達(dá)載體的篩選31-32
• 2.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化32-34
• 2.3.4 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性幼苗的鑒定34-35
• 2.3.5 轉(zhuǎn)化幼苗的定植35-36
• 2.4 討論36-38
• 第三章 轉(zhuǎn)基因棉花的鑒定及抗性分析38-54
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料38-39
• 3.1.1 棉花材料38
• 3.1.2 基因來(lái)源38
• 3.1.3 引物序列38-39
• 3.1.4 相關(guān)試劑及緩沖液39
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法39-43
• 3.2.1 T3代轉(zhuǎn)基因棉花的獲得39-40
• 3.2.2 轉(zhuǎn)基因棉花的抗性篩選40-43
• 3.3 結(jié)果與分析43-51
• 3.3.1 卡那霉素篩選濃度的確定及轉(zhuǎn)基因棉花大田篩選43-44
• 3.3.2 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)情況44-45
• 3.3.3 Southern blot結(jié)果分析45
• 3.3.4 轉(zhuǎn)基因棉花的田間農(nóng)藝性狀分析45-46
• 3.3.5 大田噴施除草劑進(jìn)行抗性鑒定46
• 3.3.6 轉(zhuǎn)基因棉花的耐受性分析46-51
• 3.4 討論51-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 致謝62-63
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文63

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