發(fā)布時間：2017-09-19 00:40

  本文關(guān)鍵詞：用雙螢光素酶報告基因技術(shù)驗證小鼠lncRNA-H19與miR-199a-5p的靶向關(guān)系

  更多相關(guān)文章： 長鏈非編碼RNA-H 微小RNA-a-p 雙螢光素酶報告基因

【摘要】：目的:構(gòu)建長鏈非編碼RNA-H19(lncRNA-H19)螢光素酶報告質(zhì)粒,利用雙螢光素酶報告基因技術(shù)驗證小鼠lncRNA-H19與微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)的靶向關(guān)系。方法:通過生物信息學網(wǎng)站RegRNA2.0預測獲取小鼠lncRNA-H19與miR-199a-5p潛在的互補結(jié)合位點。將H19及其突變體克隆到螢光素酶載體psi CHECK-2中,構(gòu)建H19野生型和突變型質(zhì)粒,并采用酶切和測序方法鑒定psi CHECK-2-H19載體是否構(gòu)建成功。將H19野生型和突變型質(zhì)粒分別與miR-199a-5p模擬物、miR-199a-5p抑制劑、miR-199a-5p模擬物陰性對照或miR-199a-5p抑制劑陰性對照在293T細胞中共轉(zhuǎn)染。收集細胞后通過雙螢光素酶報告系統(tǒng)檢測不同組別的螢光素酶活性,從而對lncRNA-H19與miR-199a-5p的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系進行驗證。結(jié)果:構(gòu)建的重組螢光素酶報告質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序鑒定正確,雙螢光素酶報告基因檢測顯示,與miR-199a-5p模擬物陰性對照組相比,miR-199a-5p模擬物組H19野生型報告基因的螢光素酶活性顯著降低,下降約49%左右(P0.01),而miR-199a-5p抑制劑組H19野生型報告基因的螢光素酶活性較miR-199a-5p模擬物組明顯增高(P0.01)。miR-199a-5p模擬物、miR-199a-5p抑制劑、miR-199a-5p模擬物陰性對照以及miR-199a-5p抑制劑陰性對照對H19突變型的螢光素酶活性均無明顯影響。結(jié)論:lncRNA-H19能夠靶向結(jié)合miR-199a-5p,并在轉(zhuǎn)錄后水平對其有直接抑制作用。
【作者單位】： 中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院急診科;中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院心內(nèi)科;
【關(guān)鍵詞】： 長鏈非編碼RNA-H 微小RNA-a-p 雙螢光素酶報告基因
【基金】：國家自然科學基金資助項目(No.81270213;No.81070125;No.81670306) 廣東省科技計劃(No.2010B031600032;No.2014A020211002) 高�；究蒲袠I(yè)務(wù)費中山大學青年教師重點培育項目(No.13ykzd16) 廣東省醫(yī)學科研基金資助項目(No.A2016264)
【分類號】：R3416
【正文快照】： 非編碼RNA在蛋白表達中具有重要調(diào)控作用。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的功能性RNA分子,其能夠從不同層面實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控作用[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長約22個核苷酸分子的內(nèi)源性非編碼RNA,通過與靶基因3’端

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本文編號：878512