本文關(guān)鍵詞：喜鹽鳶尾轉(zhuǎn)錄組分析及花青素合成關(guān)鍵基因克隆與表達(dá)分析

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【摘要】：喜鹽鳶尾(Iris halophila)具有耐鹽耐旱特性,是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ哪望}園林綠化植物。喜鹽鳶尾的花為黃白色,而它的另一個形態(tài)特征高度一致的分類學(xué)變種——藍(lán)花喜鹽鳶尾(I. halophila var. sogdiana)的花色為藍(lán)色或紫色。從分子遺傳學(xué)角度,喜鹽鳶尾是藍(lán)花喜鹽鳶尾的花青素生物合成的天然突變體,因此,喜鹽鳶尾是一種研究花青素生物合成的理想材料。本研究利用這兩種植物花蕾的內(nèi)輪花被為材料,進(jìn)行了不同花色的組織特異性轉(zhuǎn)錄組比較分析,克隆了喜鹽鳶尾花青素生物合成相關(guān)的差異表達(dá)基因片段,包括編碼查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)和類黃酮-3',5'-羥化酶類(F3'5'H-like)的基因,旨在闡明喜鹽鳶尾花青素生物合成機(jī)理與花被著色機(jī)理,并為藍(lán)花基因工程改造積累基因資源。在本研究中,分別利用兩種植物未開放的花蕾,剝?nèi)∑鋬?nèi)輪花被提取其總RNA,利用Illumina第二代測序技術(shù)進(jìn)行了高通量測序。測序片段利用NCBI NR蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和Swiss-prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了序列注釋,并通過RPKM值判斷轉(zhuǎn)錄本豐度相對差異。共從轉(zhuǎn)錄組中組裝獲得171173條轉(zhuǎn)錄本并map到35,543條Unigenes,轉(zhuǎn)錄本平均長度為479bp,Unigene平均長度750bp。對actin、tubulin、ubiquitin、磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、磷酸甘油醛脫氫酶(GPDH)、真核細(xì)胞翻譯起始因子等多個持家基因的表達(dá)分析表明,兩種植物材料的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平相近。74個Unigenes分屬于12個基因類型的花青素生物合成相關(guān)基因。根據(jù)兩個轉(zhuǎn)錄組相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的RPKM之比,初步確定了6個RPKM比大于10的差異表達(dá)基因,其中F3'5'H-like轉(zhuǎn)錄本RPKM比值高達(dá)155.17。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序組裝結(jié)果設(shè)計了相應(yīng)基因的特異引物,通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)克隆獲得了花青素生物合成相關(guān)的關(guān)鍵基因片段�？寺∑瓮ㄟ^BLASTX搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫以尋找同源基因并確定正確的讀碼框,利用Mega軟件進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生樹分析�？寺〉幕蚱我訲UBULIN為內(nèi)參基因分別在喜鹽鳶尾與藍(lán)花喜鹽鳶尾中進(jìn)行了實(shí)時定量PCR表達(dá)分析�；蚩寺〗Y(jié)果表明,在喜鹽鳶尾中分別克隆了CHS基因的326bp片段和420bp片段、CHI基因的461bp片段和F3'5'H-like基因的496bp片段；從藍(lán)花喜鹽鳶尾中克隆了CHS基因的311bp片段、CHI基因的457bp片段和F3'5'H-like基因的498bp片段。實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示CHS與F3'5'H-like基因在藍(lán)花喜鹽鳶尾中高水平表達(dá),分別是在喜鹽鳶尾中的5.27倍與3.71倍。序列分析結(jié)果表明,在藍(lán)花喜鹽鳶尾所獲得的F3'5'H-like與經(jīng)典的屬于細(xì)胞色素P450 CYP75A亞家族的F3'5'H不同,而與萬代蘭的F3'5'H-like同屬于CYP76AB亞家族,為一類新的藍(lán)花相關(guān)基因。比較轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯不F3'5'H-like在藍(lán)花喜鹽鳶尾中高水平表達(dá),與實(shí)時定量PCR驗證結(jié)果致,可能是兩種植物花色顯著差異的主要原因。
【關(guān)鍵詞】：喜鹽鳶尾 藍(lán)花喜鹽鳶尾 轉(zhuǎn)錄組分析 花青素合成 類黃酮-3' 5'-羥化酶類
【學(xué)位授予單位】：中央民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S682.19
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 縮略詞8-12
• 第一章 前言與綜述12-20
• 1.1 喜鹽鳶尾概述12-13
• 1.2 花青素與花色13-14
• 1.3 藍(lán)色花基因工程14-15
• 1.4 鳶尾屬植物花色遺傳改良研究背景15-16
• 1.5 轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)的原理與應(yīng)用16-18
• 1.6 科學(xué)問題的提出及技術(shù)路線18-20
• 第二章 轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建及花青素合成關(guān)鍵基因的篩選20-50
• 2.1 材料與方法20-23
• 2.1.1 植物材料20
• 2.1.2 主要試驗儀器20
• 2.1.3 RNA樣品的制備20-21
• 2.1.4 RNA樣品的檢測21
• 2.1.5 反轉(zhuǎn)錄21
• 2.1.6 轉(zhuǎn)錄組測序21
• 2.1.7 差異基因和關(guān)鍵基因的選取及轉(zhuǎn)錄組部分結(jié)果的驗證21-23
• 2.2 結(jié)果與分析23-45
• 2.2.1 RNA提取及質(zhì)量檢測23-24
• 2.2.2 測序結(jié)果概要24-27
• 2.2.3 Unigene聚類及功能注釋27-32
• 2.2.4 Unigene的表達(dá)量分析32-42
• 2.2.5 花青素合成差異基因及關(guān)鍵基因的選取結(jié)果42-45
• 2.2.6 轉(zhuǎn)錄組部分結(jié)果的驗證45
• 2.3 討論45-50
• 2.3.1 關(guān)于喜鹽鳶尾轉(zhuǎn)錄組測序分析45-46
• 2.3.2 數(shù)據(jù)組裝效率分析46-47
• 2.3.3 RNA-seq在不同植物群體間比較轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的有效性47
• 2.3.4 喜鹽鳶尾花青素生物合成差異表達(dá)基因47-48
• 2.3.5 喜鹽鳶尾花青素生物合成途徑與表達(dá)調(diào)控分析48-50
• 第三章 喜鹽鳶尾與藍(lán)花喜鹽鳶尾花青素合成差異基因及關(guān)鍵基因的克隆及表達(dá)分析50-66
• 3.1 材料與方法50-53
• 3.1.1 試驗材料及主要試驗儀器50
• 3.1.2 差異基因與關(guān)鍵基因克隆及表達(dá)分析50-53
• 3.2 結(jié)果與分析53-61
• 3.2.1 花青素合成差異基因及關(guān)鍵基因的克隆及序列分析53-60
• 3.2.2 花青素合成差異基因及關(guān)鍵基因的表達(dá)分析60-61
• 3.3 討論61-66
• 3.3.1 喜鹽鳶尾F3’5’H-like是不同于典型F3’5’H的新藍(lán)花基因62-63
• 3.3.2 從喜鹽鳶尾克隆CHS、CHI、LDOX等基因的特點(diǎn)63-64
• 3.3.3 F3’5'H-like與CHS的差異表達(dá)導(dǎo)致花色差異64
• 3.3.4 假基因可能導(dǎo)致花色差異64-66
• 第四章 全文結(jié)論及研究展望66-68
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 致謝73-74
• 攻讀學(xué)位期間參與的科研項目74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文74

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本文編號：874954