本文關(guān)鍵詞：Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的斑馬魚(yú)基因誘變、篩選及斑馬魚(yú)胚盾特異表達(dá)基因的鑒定

  更多相關(guān)文章： 斑馬魚(yú) Tol2基因捕獲 si:ch73-52f24.4 lncRNA sat1.a 胚盾

【摘要】：斑馬魚(yú)是一種優(yōu)良的模式動(dòng)物,其胚胎發(fā)育過(guò)程受到很多基因和信號(hào)通路的參與和調(diào)控,非常適合用來(lái)做發(fā)育生物學(xué)方面的研究以及疾病遺傳模型構(gòu)建等。突變體作為一種基因功能缺失,是研究基因功能和揭示發(fā)育機(jī)制的重要工具。為深入探究斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育過(guò)程、了解其中的發(fā)育機(jī)制,并尋找更多斑馬魚(yú)發(fā)育的研究素料,本論文研究通過(guò)Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲技術(shù)獲得綠色熒光蛋白(GFP)基因特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系。進(jìn)一步篩選到斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育相關(guān)的突變體,鑒定出發(fā)生突變的相關(guān)基因,并對(duì)其在胚胎發(fā)育過(guò)程中作用和功能做了初步分析。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)單細(xì)胞顯微注射Tol2質(zhì)粒和mRNA,共捕獲到6種特異表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系,我們對(duì)其中2種熒光出現(xiàn)較早的品系進(jìn)行了MZ(母源合子)純合體篩選,發(fā)現(xiàn)其一種突變體在母源純合體時(shí)有外包缺陷,另一種純合體雖然沒(méi)有觀察到與該基因一致的表型,但是該品系熒光在神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá),可以作為研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的有力工具,并且在其中一條F2代雌魚(yú)的子代中觀察到脊椎發(fā)育缺陷。Tol2：20141017m品系的熒光分布具有一定的時(shí)空特異性,該品系轉(zhuǎn)基因魚(yú)的熒光在母源和合子期都有表達(dá),在胚盾時(shí)期表達(dá)在邊緣區(qū)域,體節(jié)期間主要表達(dá)在脊索和體節(jié),受精后24 h表達(dá)在生肌節(jié)和卵黃合胞體。利用TAIL-PCR分析,鑒定到所捕獲的基因?yàn)閟i:ch73-52f24.4.根據(jù)與Ensembl中數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)si:ch73-52f24.4有三個(gè)轉(zhuǎn)錄本,但都不能編碼蛋白。Tol2轉(zhuǎn)座子插入到si:ch73-52f24.4的前兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的第一個(gè)內(nèi)含子中,因轉(zhuǎn)座子中自帶了尾巴結(jié)構(gòu),阻斷了這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的正常表達(dá),而第三個(gè)轉(zhuǎn)錄本從位置上看不受到影響。該轉(zhuǎn)基因突變體的母源純合體胚胎在外包過(guò)程中有明顯的缺陷：外包過(guò)程時(shí)間延長(zhǎng)、卵黃無(wú)法被完全吸收,尾芽變得扁平,一部分胚胎甚至無(wú)法發(fā)育到體節(jié)期,而能夠正常發(fā)育到24 h的胚胎的身體長(zhǎng)度較野生型短。所以我們初步分析si:ch73-52f24.4是一種重要的影響外包過(guò)程的母源的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,它可能對(duì)于胚層的分化以及體節(jié)的發(fā)育都有很重要的影響。Tol2:20141221t品系的熒光在神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達(dá),表達(dá)部位主要集中在腦部和脊椎上側(cè),使用TAIL-PCR和5'RACE鑒定發(fā)現(xiàn)所捕獲的基因?yàn)閟atl.a。它是一種亞精胺/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶(spermidine/spermine Nl-acetyltransferase),在斑馬魚(yú)中有三種同源基因。Tol2轉(zhuǎn)座子插入到第8個(gè)內(nèi)含子中,致使sat1.a基因轉(zhuǎn)錄提前終止。目前在F2代純合體沒(méi)有觀察到與該基因一致的發(fā)育缺陷,但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)4條雌魚(yú)中有一條產(chǎn)生的后代脊椎全都是彎曲的。然而這種突變類(lèi)型與熒光所在位置并不一致,目前我們還沒(méi)有弄清楚是否與該基因有關(guān),如果無(wú)關(guān),又是什么基因發(fā)生了突變。綜上論述,Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲技術(shù)作為正向遺傳學(xué)研究工具的可行性,本課題成功地捕獲到一種lncRNA,這是以前沒(méi)有人報(bào)道過(guò)的,為我們研究lncRNA提供了一種新素材；另外在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的品系可以作為一種非常好的神經(jīng)系統(tǒng)熒光標(biāo)記,可以為我們研究斑馬魚(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育提供參考。另外,作者還參與了斑馬魚(yú)胚胎胚盾特異表達(dá)基因的鑒定得工作：通過(guò)從Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因魚(yú)胚胎中分離富集GFP陽(yáng)性細(xì)胞,RNA深度測(cè)序最后確認(rèn)了isthminl,KIAA1324, rrbp1b,ripply1,twist2,nme4,zgc174153等7個(gè)基因在胚盾特異表達(dá),為下一步研究這些基因的發(fā)育生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚(yú) Tol2基因捕獲 si:ch73-52f24.4 lncRNA sat1.a 胚盾
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-21
• 1.1 斑馬魚(yú)及早期胚胎發(fā)育11-12
• 1.2 斑馬魚(yú)的基因操作和Tol2轉(zhuǎn)座子12-16
• 1.2.1 斑馬魚(yú)的基因操作12-13
• 1.2.2 轉(zhuǎn)座子和Tol2轉(zhuǎn)座子13-16
• 1.3 胚盾特異表達(dá)的基因16-18
• 1.4 本課題研究的目的、內(nèi)容和意義18-21
• 第二章 材料和方法21-35
• 2.1 斑馬魚(yú)品系和培養(yǎng)21
• 2.2 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶mRNA合成21-22
• 2.3 顯微注射和胚胎篩選22-23
• 2.3.1 胚胎準(zhǔn)備22
• 2.3.2 單細(xì)胞顯微注射22-23
• 2.3.3 胚胎培養(yǎng)和突變體品系篩選23
• 2.4 質(zhì)粒大提、基因組和總RNA提取23-26
• 2.4.1 質(zhì)粒大提23-24
• 2.4.2 基因組提取24-25
• 2.4.3 簡(jiǎn)易基因組提取25
• 2.4.4 胚胎總RNA提取25-26
• 2.5 TAI1-PCR和5'RLM-RACE26-30
• 2.5.1 熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR(TAIL-PCR)26-28
• 2.5.2 5' RLM-RACE28-30
• 2.6 探針RNA合成和原位雜交30-32
• 2.6.2 整胚原位雜交30-32
• 2.7 GFP陽(yáng)性細(xì)胞的分離富集32
• 2.8 流式細(xì)胞儀操作(Flow cytometry)32-33
• 2.9 熒光實(shí)時(shí)定量PCR和半定量RT-PCR33-35
• 2.9.1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR33
• 2.9.2 半定量RT-PCR(Semi-quantitative Reverse Transcription PCR)33-35
• 第三章 結(jié)果35-53
• 3.1 Tol2：20141017m品系和si：ch73-52f24.435-41
• 3.1.1 檢測(cè)Tol2：20141017m GFP在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)圖式35-36
• 3.1.2 Tol2：20141017m品系母源表達(dá)的不完全性36-37
• 3.1.3 基因連鎖分析si：ch73-52f24.4和Tol2轉(zhuǎn)座子之間是連鎖的37-38
• 3.1.4 TAIL-PCR鑒定到基因所在位置38-39
• 3.1.5 原位雜交證明確實(shí)為該基因39
• 3.1.6 表型分析發(fā)現(xiàn)該品系在外包過(guò)程中有缺陷39-41
• 3.2 Tol2：20141221t品系和sat1.a41-47
• 3.2.1 檢測(cè)Tol2：20141221t品系胚胎中GFP在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)圖式41-42
• 3.2.2 鑒定到Tol2：20141221t品系中Tol2轉(zhuǎn)座子捕獲的基因?yàn)閟at1.a42-43
• 3.2.3 sat1.a基因具有與Tol2：20141221t品系GFP相似的表達(dá)圖式43-45
• 3.2.4 sat1.a突變體沒(méi)有明顯的發(fā)育缺陷45-46
• 3.2.5 發(fā)現(xiàn)與預(yù)期不相符的表型46-47
• 3.3 斑馬魚(yú)胚胎胚盾特異表達(dá)基因的鑒定47-53
• 3.3.1 Tg(gsc：GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎適合于分離富集胚盾中胚層細(xì)胞47-48
• 3.3.2 流式細(xì)胞分選獲得高純度的GFP陽(yáng)性細(xì)胞48-49
• 3.3.3 系統(tǒng)鑒定胚盾高表達(dá)基因49-51
• 3.3.4 原位雜交確定胚盾特異表達(dá)的基因51-53
• 第四章 結(jié)論和討論53-57
• 4.1 捕獲到一個(gè)lncRNA53
• 4.2 sat1.a可以作為一個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)分子標(biāo)記53-54
• 4.3 突變體中GFP的翻譯并不一定依賴(lài)插入基因的啟動(dòng)密碼子54
• 4.4 Tol2介導(dǎo)的基因捕獲技術(shù)一個(gè)非常好的正向遺傳學(xué)研究工具54
• 4.5 我們鑒定到胚盾高表達(dá)基因54-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 附錄63-69
• 測(cè)序結(jié)果63-65
• Tol2：20141017m品系TAIL-PCR測(cè)序結(jié)果(T3-3)63
• Tol2：20141017m品系cDNA鑒定測(cè)序結(jié)果(連接載體PUC19測(cè)序引物M13F)63-64
• Tol2：20141221t品系TAIL-PCR測(cè)序結(jié)果(引物T3-3)64
• Tol2：20141221t品系5'RACE測(cè)序結(jié)果(引物eGFP1)64-65
• 試劑配制65-69
• 質(zhì)粒大提試劑65
• 基因組提取試劑65
• 原位雜交所需溶液的配制65-67
• 流式細(xì)胞所需溶液配制67-69
• 發(fā)表文章與獲獎(jiǎng)情況69-71
• 發(fā)表文章69
• 獲獎(jiǎng)情況69-71
• 致謝71

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 孫智慧;孟安明;;斑馬魚(yú)胚胎中受Nodal信號(hào)調(diào)控基因的鑒定[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2007年06期

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本文編號(hào)：867457