本文關(guān)鍵詞：AcMNPV中LEF-10過量表達(dá)與聚集對(duì)病毒晚期基因表達(dá)的影響

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【摘要】：lef-10基因作為苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)的必需基因,其主要參與了病毒DNA的復(fù)制和晚期基因表達(dá),屬于晚期表達(dá)因子。在之前的研究中發(fā)現(xiàn),LEF-10在大腸桿菌中能夠形成高分子量的復(fù)合體并且這種復(fù)合體的存在是極其穩(wěn)定的,而我們?cè)赟f9細(xì)胞中也同樣觀察到了LEF-10在細(xì)胞質(zhì)中形成的聚集體,這種聚集體對(duì)病毒的復(fù)制以及晚期基因的表達(dá)產(chǎn)生的影響,將是本實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以p10啟動(dòng)子控制的mCherry作為報(bào)告基因,對(duì)宿主細(xì)胞中LEF-10的表達(dá)和分布情況以及mCherry的表達(dá)水平進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)LEF-10均勻分布于細(xì)胞核中時(shí),能夠正常發(fā)揮其功能,使得極晚期基因正常表達(dá),一旦LEF-10在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生聚集,其不能進(jìn)入到細(xì)胞核中,導(dǎo)致宿主細(xì)胞核中的LEF-10減少,不足以支撐某些晚期基因與極晚期基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng),從而使得極晚期啟動(dòng)子p10啟動(dòng)的mCherry表達(dá)量下降。我們根據(jù)這一結(jié)論,建立了LEF-10聚集對(duì)基因表達(dá)影響的模型。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)LEF-101-65在自身啟動(dòng)子下表達(dá)量要稍低于野生型,它只能恢復(fù)全長(zhǎng)LEF-10的部分功能。而為了進(jìn)一步確定LEF-10的過量表達(dá)對(duì)LEF-10的聚集以及晚期基因表達(dá)的影響,我們根據(jù)截短型LEF-101-65的功能與野生型LEF-10相當(dāng),但不易在細(xì)胞中發(fā)生聚集的特點(diǎn),分別構(gòu)建了p10啟動(dòng)子下LEF-10和LEF-101-65過量表達(dá)的重組桿狀病毒,在感染Sf9細(xì)胞后,對(duì)宿主細(xì)胞中LEF-10以及LEF-101-65的表達(dá)情況進(jìn)行了分析并檢測(cè)了某些晚期基因的表達(dá)水平,由于LEF-101-65在自身啟動(dòng)子下表達(dá)量要稍低于野生型,它只能恢復(fù)全長(zhǎng)LEF-10的部分功能,發(fā)現(xiàn)由p10啟動(dòng)子啟動(dòng)的LEF-10的表達(dá)量要明顯低于LEF-101-65的表達(dá)量,表明LEF-10的過量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致極晚期基因p10的表達(dá)量下降。我們認(rèn)為在LEF-10過量表達(dá)時(shí),大量LEF-10在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生聚集,病毒晚期基因以及極晚期基因的表達(dá)水平降低;而在LEF-101-65過量表達(dá)的宿主細(xì)胞中,則不會(huì)發(fā)生LEF-101-65的大量聚集,使得晚期基因以及極晚期基因的表達(dá)不受影響。為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn),我們選取了五種晚期表達(dá)基因pp78/83,vp39,sod,odv-e56,vp-80并檢測(cè)了其表達(dá)水平,進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建LEF-10正常表達(dá)以及過量表達(dá)的重組病毒,驗(yàn)證了LEF-10在Sf9細(xì)胞中的聚集對(duì)晚期基因表達(dá)的影響,并由此構(gòu)建了LEF-10的聚集與其功能的關(guān)系模型,為進(jìn)一步研究LEF-10的功能奠定了基礎(chǔ),也為其他能形成復(fù)合物的蛋白的研究提供了新途徑。
【關(guān)鍵詞】：苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV) LEF-10 蛋白質(zhì)聚集 晚期基因表達(dá) 草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞系(Sf9)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q786
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-21
• 1.1 桿狀病毒概述11-15
• 1.1.1 桿狀病毒的起源及分類11-12
• 1.1.2 桿狀病毒的形態(tài)特征及感染周期12-14
• 1.1.3 苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒14-15
• 1.2 桿狀病毒晚期表達(dá)因子15-18
• 1.2.1 晚期表達(dá)因子15-16
• 1.2.2 其它lef基因介紹16-18
• 1.3 蛋白表達(dá)系統(tǒng)18-19
• 1.4 實(shí)驗(yàn)?zāi)康�、意義及立項(xiàng)依據(jù)19-21
• 第二章 Lef-10聚集的分布及影響21-31
• 2.1 材料與試劑21-22
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒21
• 2.1.2 生化試劑21
• 2.1.3 主要溶液配方21-22
• 2.1.4 主要儀器22
• 2.1.5 引物設(shè)計(jì)與合成22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-26
• 2.2.1 野生型pTriEx- plef-10_lef10GFP-pp10_mCherry質(zhì)粒構(gòu)建22-24
• 2.2.2 截短型pTriEx- plef-10_lef10165-GFP-pp10_mC herry質(zhì)粒構(gòu)建24-25
• 2.2.3 包裝重組桿狀病毒25
• 2.2.4 極限稀釋法測(cè)定病毒滴度25-26
• 2.2.5 重組型桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞26
• 2.2.6 熒光顯微鏡觀察LEF-10在Sf9細(xì)胞中的狀態(tài)26
• 2.2.7 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)26
• 2.3 結(jié)果與分析26-31
• 2.3.1 重組質(zhì)粒pTriEx- plef-10_lef10GFP-pp10_mCherry的克隆26-27
• 2.3.2 截短型pTriEx- plef-10_lef10165-GFP-pp10_mC herry質(zhì)粒的克隆27-28
• 2.3.3 LEF-10聚集導(dǎo)致其功能下調(diào)28-29
• 2.3.4 LEF-10羧基端截短對(duì)p10表達(dá)的影響29-31
• 第三章 hsp70啟動(dòng)子啟動(dòng)LEF-10過量表達(dá)31-41
• 3.1 材料與試劑31-32
• 3.1.1 菌株與質(zhì)粒31
• 3.1.2 生化試劑31
• 3.1.3 主要溶液配方31
• 3.1.4 主要儀器31
• 3.1.5 引物設(shè)計(jì)與合成31-32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法32-36
• 3.2.1 野生型及截短型LEF-10過量表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建32-33
• 3.2.2 熱啟動(dòng)LEF-10過量表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建33-35
• 3.2.3 包裝重組桿狀病毒35
• 3.2.4 熱啟動(dòng)Hsp70過表達(dá)lef-1035-36
• 3.2.5 倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)36
• 3.2.6 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)36
• 3.3 結(jié)果與分析36-41
• 3.3.1 野生型及截短型LEF-10過量表達(dá)質(zhì)粒的克隆36-37
• 3.3.2 熱啟動(dòng)LEF-10過量表達(dá)質(zhì)粒的克隆37-38
• 3.3.3 熱啟動(dòng)LEF-10過量表達(dá)熒光結(jié)果38-40
• 3.3.4 lef-10過量表達(dá)流式細(xì)胞結(jié)果40-41
• 第四章 LEF-10聚集對(duì)晚期基因表達(dá)水平影響41-46
• 4.1 材料與試劑41-42
• 4.1.1 重組病毒41
• 4.1.2 生化試劑41
• 4.1.3 主要溶液配方41
• 4.1.4 主要儀器41
• 4.1.5 引物設(shè)計(jì)與合成41-42
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法42-43
• 4.2.1 極限稀釋法測(cè)定病毒滴度42
• 4.2.2 重組型桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞42
• 4.2.3 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)42
• 4.2.4 Sf9細(xì)胞RNA提取42-43
• 4.2.5 DNA酶處理及反轉(zhuǎn)錄43
• 4.2.6 半定量PCR檢測(cè)病毒晚期基因表達(dá)43
• 4.3 結(jié)果與分析43-46
• 4.3.1 LEF-10羧基末端截短影響LEF-10過量表達(dá)43-44
• 4.3.2 Sf9細(xì)胞RNA提取結(jié)果44-45
• 4.3.3 LEF-10羧基末端截短對(duì)晚期基因表達(dá)的影響45-46
• 第五章 討論46-49
• 第六章 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 縮略詞56-57
• 致謝57-58
• 作者簡(jiǎn)介58

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 谷鴻喜,陳健華,鐘照華,郭彩珍;HPV_(16)L_1晚期基因陽性表達(dá)重組菌株的篩選[J];生物技術(shù);1998年02期

2 郭淑元,凌虹,莊敏,林道紅,郭彩玲,谷鴻喜;人乳頭瘤病毒16型晚期基因L1在大腸桿菌中的表達(dá)[J];微生物學(xué)雜志;2000年04期

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 周新宇;AcMNPV中LEF-10過量表達(dá)與聚集對(duì)病毒晚期基因表達(dá)的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：851196