本文關(guān)鍵詞：山楂矢車菊素-3-O-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因篩選、克隆及功能驗(yàn)證

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【摘要】：花色苷是廣泛分布于自然界的一種水溶性植物色素,具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、防治心血管疾病等多種生物活性�；ㄉ找资芄庹铡囟�、pH值影響,分離純化花色苷單體比較困難,導(dǎo)致花色苷對照品市場售價(jià)極高；還有些種類的花色苷由于在植物中含量極低,無法通過化學(xué)分離的手段得到。生物合成技術(shù)為大量獲得有效成分提供了新的思路,近年來有關(guān)花色苷生物合成與調(diào)控機(jī)制的研究已在玉米、擬南芥、葡萄、蘋果等植物中取得了進(jìn)展。山楂(山里紅Crataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br或山楂C. pinnatifida Bge.)是傳統(tǒng)中藥,近年來常用于心血管疾病的治療,其藥效與山楂中所含的黃酮類成分密切相關(guān)。課題組前期研究表明,山楂果實(shí)中花色苷類成分主要為矢車菊素-3-O-半乳糖苷(Cyanidin-3-O-galactoside, Cy-3-O-Gal)和矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷,且這兩種成分含量低,單體的提取分離比較困難。本研究擬將化學(xué)分析和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合,對山楂中花色苷類成分進(jìn)行研究,旨在獲得山楂果實(shí)花色苷生物合成的關(guān)鍵酶及其編碼基因,為通過生物合成的手段獲得花色苷類成分奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容主要分為4個(gè)部分。第一章為文獻(xiàn)綜述一方面,對山楂化學(xué)成分及成分分析方面的報(bào)道進(jìn)行分析整理,為開展不同發(fā)育期山楂果實(shí)有效成分變化規(guī)律提供了技術(shù)參考；另一方面,綜述了花色苷類成分提取分離、成分分析、藥效活性以及生物合成等方面的研究,研究表明花色苷類成分有良好的藥效活性及應(yīng)用價(jià)值,僅依靠化學(xué)分離技術(shù)已不能滿足花色苷的應(yīng)用需求,急需一種高效的獲得花色苷類成分的方法；另外,有關(guān)花色苷類成分生物合成方面的研究已經(jīng)有大量的研究基礎(chǔ),為今后開展山楂果實(shí)花色苷類成分的合成生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。第二章為不同發(fā)育期山楂果實(shí)有效成分含量變化規(guī)律研究采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對山楂樣品制備方法進(jìn)行優(yōu)化,建立了山楂果實(shí)中表兒茶素、原花青素B2 (Procyanidin B2, PC B2)、金絲桃苷、異槲皮苷、綠原酸、熊果酸、Cy-3-O-Gal7種化學(xué)成分的含量測定方法,并對不同發(fā)育期山楂果實(shí)中這7種成分進(jìn)行了含量測定。結(jié)果表明,在山楂果實(shí)發(fā)育過程中表兒茶素、PCB2、金絲桃苷、異槲皮苷、綠原酸、熊果酸、Cy-3-O-Gal含量(干燥重量,Drymass, DM)變化范圍分別為4.932～19.315 mg/g、2.218～14.549 mg/g、0.066～0.184 mg/g、0.053～0.117 mg/g、0.532～1.834 mg/g、2.163～5.942 mg/g、0.005～0.188 mg/g�；ㄉ蘸吭诠麑�(shí)即將成熟時(shí)迅速增加,在成熟時(shí)達(dá)到最大值,表兒茶素和PCB2則與花色苷變化趨勢不同,在果實(shí)趨向成熟的階段其含量逐漸減少。第三章為山楂果實(shí)花色苷生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的篩選本研究以不同發(fā)育期山楂果實(shí)為研究材料,以改良CTAB法提取山楂果實(shí)總RNA,并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測序,同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR, RT-PCR),對花色苷生物合成途徑12個(gè)基因家族的28個(gè)基因在山楂果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示Cp4CL2、Cp4CL3、 Cp4CL4、Cp4CL5、CpCHI1、CpCHI2、CpCH3、CpF3H1、CpF3'5'H1、CpF3'5'H2、 CpF3'5'H3、CpF3'5'H4、CpF3'5'H5、CpLDOXl和Cp3OGT基因與花色苷成分有顯著的正向相關(guān)關(guān)系,預(yù)示著上述基因可能是參與山楂果實(shí)花色苷生物合成的關(guān)鍵酶基因,為花色苷的生物合成提供了參考資料。第四章為山楂果實(shí)Cp3OGT基因的克隆和功能分析本研究從山楂果實(shí)轉(zhuǎn)錄組中獲得Cp3OGT基因序列,設(shè)計(jì)特異性引物,克隆該基因全長cDNA序列,并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及基因表達(dá)模式分析。結(jié)果表明,Cp3OGT基因完整的ORF開放閱讀框位于38-1486 bp,編碼482 aa的蛋白質(zhì),分子量約為52 KDa；該蛋白具有“UDPGT'’的結(jié)構(gòu)功能域,基因表達(dá)分析表明Cy-3-O-Gal含量與Cp3OGT基因相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.8513。為了驗(yàn)證其功能,將重組的pET28a-Cp3OGT載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá),采用經(jīng)過SDS-PAGE電泳鑒定正確的蛋白用于體外酶促反應(yīng)。然后采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對酶促反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,通過比對保留時(shí)間和離子對數(shù)據(jù),明確酶促反應(yīng)產(chǎn)物為Cy-3-O-Gal,表明Cp3OGT蛋白具有催化矢車菊素合成Cy-3-C-Gal的活性。綜上所述,本文建立了山楂果實(shí)7種成分的HPLC含量測定方法,對不同發(fā)育期山楂果實(shí)中有效成分含量變化規(guī)律進(jìn)行研究；首次研究了山楂果實(shí)花色苷生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)情況,并結(jié)合其與化學(xué)成分含量的相關(guān)性,預(yù)測了可能的關(guān)鍵酶基因,并進(jìn)一步從山楂果實(shí)中克隆關(guān)鍵酶Cp3OGT基因全長,并對其功能進(jìn)行鑒定,為解析山楂果實(shí)中花色苷類成分的生物合成途徑和合成生物學(xué)研究提供了參考資料。
【關(guān)鍵詞】：山楂 成分分析 花色苷 矢車菊素-3-O-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶 功能驗(yàn)證
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;Q946
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 縮略語中英文對照表13-14
• 前言14-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-27
• 1.1 山楂化學(xué)成分研究進(jìn)展15-20
• 1.1.1 山楂化學(xué)成分概述15-16
• 1.1.2 山楂化學(xué)成分分析研究現(xiàn)狀16-20
• 1.2 花色苷類成分研究進(jìn)展20-27
• 1.2.1 花色苷提取分離研究現(xiàn)狀20-22
• 1.2.2 花色苷類成分分析研究現(xiàn)狀22-23
• 1.2.3 花色苷類成分的藥效活性23-24
• 1.2.4 花色苷生物合成研究概況24-27
• 第二章 不同發(fā)育期山楂果實(shí)有效成分含量變化規(guī)律研究27-42
• 2.1 材料27-28
• 2.1.1 樣品的收集27
• 2.1.2 儀器與試劑27-28
• 2.2 方法與結(jié)果28-40
• 2.2.1 HPLC色譜條件28
• 2.2.2 供試品溶液的制備28-29
• 2.2.3 色譜峰的定性29-30
• 2.2.4 線性關(guān)系考察30-31
• 2.2.5 樣品溶液制備方法考察31-34
• 2.2.6 方法學(xué)考察34-38
• 2.2.7 不同發(fā)育期山楂果實(shí)有效成分含量測定38-40
• 2.3 討論40-42
• 2.3.1 花色苷分析方法的優(yōu)化40
• 2.3.2 不同發(fā)育期山楂果實(shí)有效成分含量變化規(guī)律40-42
• 第三章 山楂果實(shí)花色苷生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的篩選42-62
• 3.1 材料42-43
• 3.1.1 植物材料42
• 3.1.2 儀器與試劑42-43
• 3.2 方法43-50
• 3.2.1 山楂果實(shí)總RNA的提取及檢測43-44
• 3.2.2 De novo轉(zhuǎn)錄組高通量測序及分析44-46
• 3.2.3 第一鏈cDNA合成46-47
• 3.2.4 關(guān)鍵酶基因分析47-48
• 3.2.5 引物設(shè)計(jì)48
• 3.2.6 RT-PCR測定基因表達(dá)量48-49
• 3.2.7 數(shù)據(jù)分析49-50
• 3.3 結(jié)果與分析50-59
• 3.3.1 山楂果實(shí)總RNA提取結(jié)果50
• 3.3.2 轉(zhuǎn)錄組高通量測序50-52
• 3.3.3 花色苷合成關(guān)鍵酶基因分析52-55
• 3.3.4 不同發(fā)育期山楂果實(shí)基因表達(dá)量分析55-58
• 3.3.5 山楂果實(shí)基因表達(dá)與化學(xué)成分的關(guān)系58-59
• 3.4 討論59-62
• 3.4.1 山楂果實(shí)總RNA提取59-60
• 3.4.2 花色苷生物合成相關(guān)基因60-62
• 第四章 山楂果實(shí)Cp3OGT基因的克隆和功能分析62-75
• 4.1 材料62-63
• 4.1.1 儀器62
• 4.1.2 試劑62-63
• 4.2 方法與結(jié)果63-73
• 4.2.1 山楂果實(shí)Cp3OGT基因cDNA全長克隆63-65
• 4.2.2 Cp3OGT基因cDNA的生物信息、學(xué)分析65-70
• 4.2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)70
• 4.2.4 酶粗提物的制備70-71
• 4.2.5 Cp3OGT體外酶促反應(yīng)71-72
• 4.2.6 反應(yīng)產(chǎn)物L(fēng)C-MS鑒定72-73
• 4.3 討論73-75
• 第五章 全文小結(jié)75-77
• 參考文獻(xiàn)77-83
• 致謝83-84
• 個(gè)人簡歷84

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本文編號：845465