本文關(guān)鍵詞：表達(dá)1型和3型鴨甲肝病毒VP1基因重組新城疫病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究

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【摘要】：鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是一種高度致死性傳染病,由鴨甲肝病毒(Duck Hepatitis A Virus,DHAV)引起,其特點(diǎn)為發(fā)病急、傳播快、病程短、病死率高,主要侵害三周齡以內(nèi)的雛鴨,給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。當(dāng)前DHAV-1和DHAV-3是國(guó)內(nèi)流行的主要血清型,中國(guó)內(nèi)地尚未見分離到DHAV-2的報(bào)道。目前鴨病毒性肝炎卵黃抗體和鴨甲型肝炎活疫苗是防治鴨肝炎的主要措施,常規(guī)疫苗在防制方面存在一定的不足,因此需要研制更安全、有效的新型疫苗。新城疫(Newcastle Disease,ND)是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病之一,近年來(lái),新城疫對(duì)鴨的危害日趨嚴(yán)重。控制新城疫的主要措施是疫苗接種和嚴(yán)格的生物安全措施,隨著反向遺傳操作技術(shù)的深入發(fā)展,新城疫病毒活載體疫苗得到廣泛的研究和應(yīng)用。為了研發(fā)一種安全有效的雙價(jià)苗,本研究以NDV LaSota弱毒疫苗株為載體,構(gòu)建共表達(dá)DHAV 1型和3型VP1基因的重組NDV活疫苗,用于1型、3型鴨病毒性肝炎和鴨新城疫的預(yù)防,不僅可以彌補(bǔ)當(dāng)前DHAV-3疫苗的空白,還可達(dá)到一針?lè)蓝嗖〉男Ч�。本研究主要主要包括以下四部分�?nèi)容:1.表達(dá)鴨肝炎1型和3型VP1基因重組新城疫病毒載體的構(gòu)建利用Trizol試劑提取DHAV-1和DHAV-3病毒RNA,分別擴(kuò)增得到DHAV 1VP1-2A和DHAV 3VP1基因。利用SOE PCR方法進(jìn)行1型和3型鴨甲肝病毒VP1基因的連接,擴(kuò)增產(chǎn)物DHAV 1VP-2A-3VP1經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),目的片段約為2368bp,與預(yù)期相符。以含有LaSota全長(zhǎng)cDNA的重組質(zhì)粒p LS-RFP(P基因和F基因間插有RFP報(bào)告基因)為載體,利用In-Fusion?PCR Cloning Kit將目的基因DHAV 1VP1-2A-3VP1插入到新城疫基因組P基因和F基因間,構(gòu)建含有1型、3型鴨甲肝病毒VP1基因重組質(zhì)粒p LS-1VP1-2A-3VP1,進(jìn)一步PCR檢測(cè)和序列測(cè)定證實(shí)DHAV 1VP-2A-3VP1基因正確插入到p LS載體中。2.重組病毒rLS-1VP1-2A-3VP1的拯救為了從克隆的cDNA中拯救感染性NDV,將重組質(zhì)粒pLS-1VP1-2A-3VP1與表達(dá)NDV NP、P、L蛋白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEp-2細(xì)胞。收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清接種于10日齡SPF雞胚,在雞胚中連續(xù)傳代。將拯救病毒命名為rLS-1VP1-2A-3VP1,并通過(guò)HA、RT-PCR、IFA等試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果表明,重組病毒r LS-1VP1-2A-3VP1被成功拯救。3.重組病毒的生物學(xué)特性測(cè)定通過(guò)重組病毒株r LS-1VP1-2A-3VP1對(duì)雞胚的半數(shù)感染量(EID50)、平均雞胚致死時(shí)間(MDT)、1日齡SPF雞腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)、6周齡SPF雞靜脈內(nèi)致病指數(shù)(IVPI)和生長(zhǎng)曲線的測(cè)定,結(jié)果表明重組病毒rLS-1VP1-2A-3VP1成功拯救出并保持了原重組疫苗株rLS-RFP對(duì)雞胚的高滴度生長(zhǎng)適應(yīng)和低致病的特性。4.種鴨免疫試驗(yàn)本研究選用種鴨進(jìn)行免疫試驗(yàn),通過(guò)種鴨的多次免疫保證雛鴨有較高的母源抗體,能安全渡過(guò)危險(xiǎn)期。雛鴨免疫效果有待進(jìn)一步證實(shí)。將E5代重組病毒rLS-1VP1-2A-3VP1(病毒毒價(jià)107.2EID50/0.1mL)經(jīng)點(diǎn)眼滴鼻免疫4月齡種鴨,每羽1mL,初次免疫10天后采血,采用固定病毒-稀釋血清法做血清中和試驗(yàn),重組病毒免疫種鴨血清中DHAV-1和DHAV-3抗體平均效價(jià)分別為1:18.17和1:16.60,表明該重組毒可誘導(dǎo)種鴨產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體。利用Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證重組病毒r LS-1VP1-2A-3VP1免疫種鴨血清能和DHAV-1和DHAV-3 VP1表達(dá)蛋白發(fā)生較強(qiáng)的反應(yīng)。以上結(jié)果表明重組病毒rLS-1VP1-2A-3VP1具有作為用于種鴨免疫的鴨肝炎重組病毒活載體疫苗的潛力。
【關(guān)鍵詞】：新城疫 鴨肝炎 反向遺傳操作 活載體疫苗
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 引言12-22
• 1.1 新城疫反向遺傳操作研究進(jìn)展12-19
• 1.1.1 新城疫病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)及分子生物學(xué)特征12-13
• 1.1.2 NDV的安全性評(píng)價(jià)13
• 1.1.3 NDV的反向遺傳學(xué)技術(shù)13-14
• 1.1.4 新城疫的反向遺傳系統(tǒng)的組成14-16
• 1.1.5 NDV作為疫苗載體的研究進(jìn)展16-19
• 1.2 鴨病毒性肝炎疫苗研究進(jìn)展19-21
• 1.2.1 滅活疫苗19
• 1.2.2 弱毒疫苗19-20
• 1.2.3 基因工程疫苗20-21
• 1.3 本研究的目的和意義21-22
• 2 材料與方法22-47
• 2.1 材料22-24
• 2.1.1 病毒株、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物22
• 2.1.2 主要儀器22
• 2.1.3 主要試劑22-23
• 2.1.4 主要試劑的配制23-24
• 2.2 方法24-47
• 2.2.1 1型、3型DHAV VP1基因的連接24-30
• 2.2.2 表達(dá)DHAV 1VP1-2A-3VP1重組新城疫病毒的構(gòu)建30-37
• 2.2.3 重組病毒rLS-1VP1-2A-3VP1的拯救37-40
• 2.2.4 HA和HI的測(cè)定40
• 2.2.5 重組病毒的RT-PCR鑒定40-41
• 2.2.6 重組病毒的電鏡觀察41-42
• 2.2.7 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）42
• 2.2.8 重組病毒滴定、致病性及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)42-44
• 2.2.9 種鴨免疫試驗(yàn)44-45
• 2.2.10 Western blot45-47
• 3 結(jié)果和分析47-55
• 3.1 1型、3型DHAV VP1基因的連接47-48
• 3.1.1 SOE-PCR連接DHAV-1VP1-2A和DHAV-3VP147
• 3.1.2 質(zhì)粒pT-1VP1-2A-3VP1的提取和酶切鑒定47-48
• 3.2 表達(dá)DHAV-1VP1-2A-3VP1重組新城疫病毒的構(gòu)建48-50
• 3.2.1 PCR線性化新城疫病毒載體48-49
• 3.2.2 線性化新城疫載體的病毒純化49
• 3.2.3 In-Fusion連接反應(yīng)49
• 3.2.4 重組質(zhì)粒p LS-1VP1-2A-3VP1的鑒定49-50
• 3.3 重組病毒rLS-1VP1-2A-3VP1的拯救50-51
• 3.4 重組病毒的RT-PCR鑒定51
• 3.5 病毒滴定、致病性及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)51-52
• 3.6 電鏡觀察52-53
• 3.7 IFA鑒定53
• 3.8 重組病毒免疫種鴨血清中DHAV-1 和DHAV-3 抗體的檢測(cè)53-54
• 3.9 Western blot鑒定54-55
• 4 討論55-57
• 4.1 重組新城疫病毒的拯救55-56
• 4.2 種鴨免疫試驗(yàn)56
• 4.3 重組NDV構(gòu)建的改善56-57
• 5 結(jié)論57-58
• 6 參考文獻(xiàn)58-63
• 7 致謝63

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