本文關鍵詞：S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因工程菌的構建及活性分析

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【摘要】：S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)在真核細胞中具有重要的甲基循環(huán)代謝調節(jié)作用,是存在于生物細胞內調節(jié)甲基反應的一種水解酶,此水解酶廣泛存在于真核細胞如:人類、植物、真菌中。SAHH其主要的功能是催化S-腺苷高半胱氨酸(SAH)水解生成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)的可逆反應。研究表明人體內S-腺苷高半胱氨酸水解酶水平的高低可能影響冠心病和阿爾茨海默癥即老年癡呆病的發(fā)病概率。為了更好的研究該酶,我們通過基因克隆技術將人源表達SAHH的基因整合到畢赤酵母菌基因組上,成功構建真核表達體系,再利用畢赤酵母菌表達該目的蛋白SAHH。具體的實驗方案如下:首先,我們從GenBank中查找到編碼人源的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因,在此目的基因前后設計酶切位點和重組標簽His-tag。通過全基因合成技術合成擁有完整編碼框的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因,構建pPIC9K-sahh表達載體。然后,利用同尾酶Bgl II酶切克隆載體,通過電轉化使其整合到畢赤酵母菌GS115的基因組中,用遺傳霉素G418篩選出高拷貝轉化子,轉化子通過MD和MM平板鑒定其表型為Mut S型。經菌體PCR驗證后,將篩選到的陽性轉化子用1%甲醇誘導,使其分泌SAHH蛋白,之后我們利用冷凍干燥器將產物濃縮,利用0.22μm的濾膜過濾雜質和晶體。最后,我們將濃縮后的液體通過Ni-NTA親和層析對重組SAHH蛋白進行純化。此方法具有篩選方便、蛋白產物分泌表達穩(wěn)定和易于純化等優(yōu)點。人源sahh基因包含1299個堿基對,其編碼432個氨基酸,因此理論上此水解酶的相對分子量約為47.5 kDa,通過SDS-PAGE得出發(fā)酵產物的條帶大小約為48 kDa。由于SAH被SAHH一步水解為高半胱氨酸和腺苷,而高半胱氨酸可直接用Ellman試劑直接定量測定,在412 nm下吸光度隨著產物的升高而升高,我們測得濃縮后的SAHH蛋白酶活為626.6 IU,而經過Ni-NTA親和層析純化后的SAHH蛋白酶活為1106.8 IU。而對照組即sahh基因沒有整合到畢赤酵母菌GS115基因組上的菌體通過此方法發(fā)酵得到的產物,測其酶活性約為1.33 IU,因此對于畢赤酵母菌GS115本身的發(fā)酵產物對本實驗的研究結果可以忽略不計。同時我們通過查閱文獻獲知有些研究通過對表達體系的表達條件進行優(yōu)化后酶活可達到1600 IU相比我們所得的酶活較高,但是我相信我們在之后的對表達體系的表達條件進行優(yōu)化后一定比1600 IU高。結論:此研究中我們成功構建畢赤酵母菌真核表達體系,同時使得SAHH在畢赤酵母中獲得了高效分泌表達。我們的研究結果可與在病原菌中功能相似的甲基化有關的S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)的結構進行差異比較,篩選特異性抑制病原菌SAHN酶活性但不影響SAHH的天然化合物抑制劑。
【關鍵詞】：S-腺苷高半胱氨酸水解酶 構建表達載體 畢赤酵母表達
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-14
• 第一章 前言14-24
• 1.1 S-腺苷高半胱氨酸水解酶14-24
• 1.1.1 S-腺苷高半胱氨酸水解酶概論14-15
• 1.1.2 S-腺苷高半胱氨酸水解酶作用底物的生成15-17
• 1.1.2.1 S-腺苷高半胱氨酸再次甲基化途徑16
• 1.1.2.2 S-腺苷高半胱氨酸轉硫基途徑16-17
• 1.1.3 S-腺苷高半胱氨酸水解酶的結構17-18
• 1.1.4 SAHH蛋白表達系統(tǒng)的選擇18-21
• 1.1.4.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)19
• 1.1.4.2 酵母菌表達系統(tǒng)19-21
• 1.1.5 S-腺苷高半胱氨酸水解酶研究進展21-24
• 第二章 實驗材料、儀器與方法24-40
• 2.1 實驗材料24-25
• 2.2 實驗儀器25-26
• 2.3 實驗試劑和培養(yǎng)基的配制26-27
• 2.3.1 實驗試劑的配制26
• 2.3.2 培養(yǎng)基的配制26-27
• 2.4 實驗方法27-40
• 2.4.1 S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因sahh的獲得27-28
• 2.4.1.1 人源sahh基因的選擇27-28
• 2.4.1.2 全基因合成基因序列構建載體及PCR引物設計28
• 2.4.2 目的基因的獲取28-31
• 2.4.2.1 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞的制備28
• 2.4.2.2 轉化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞28-29
• 2.4.2.3 陽性克隆菌體的鑒定29-30
• 2.4.2.4 雙酶切反應檢驗質粒30
• 2.4.2.5 線性化質粒30-31
• 2.4.2.6 線性化質粒的膠回收31
• 2.4.3 畢赤酵母菌GS115表達載體的構建31-34
• 2.4.3.1 畢赤酵母菌GS115感受態(tài)細胞的制備32
• 2.4.3.2 畢赤酵母菌GS115電轉化32-33
• 2.4.3.3 畢赤酵母GS115轉化子的篩選與鑒定33-34
• 2.4.4 畢赤酵母GS115轉化子產酶的誘導34-35
• 2.4.4.1 甲醇誘導GS115轉化子表達SAHH34-35
• 2.4.4.2 SAHH蛋白液的濃縮35
• 2.4.5 親和層析35-38
• 2.4.5.1 SAHH蛋白親和層析35-36
• 2.4.5.2 SAHH蛋白洗脫液除鹽36
• 2.4.5.3 SDS-PAGE定量分析SAHH蛋白36-38
• 2.4.6 SAHH蛋白活性測定38-40
• 2.4.6.1 SAHH蛋白活性測定的原理38
• 2.4.6.2 制作標準曲線38
• 2.4.6.3 SAHH蛋白活性測定方法38-40
• 第三章 實驗結果與分析40-52
• 3.1 PPIC9K、PPIC9K-SAHH質粒的提取40-41
• 3.2 PPIC9K-SAHH雙酶切反應驗證41-42
• 3.3 PPIC9K-SAHH和PPIC9K質粒線性化42-43
• 3.4 線性化質粒PPIC9K-SAHH和PPIC9K的膠回收43-44
• 3.5 轉化子篩選與驗證44-47
• 3.5.1 高拷貝轉化子的篩選44-46
• 3.5.2 PCR產物測序46-47
• 3.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳結果47-49
• 3.7 SAHH蛋白活性測定49-52
• 3.7.1 半胱氨酸標準曲線的繪制49-50
• 3.7.2 SAHH蛋白活性測定50-52
• 第四章 結論與展望52-54
• 參考文獻54-60
• 致謝60-62
• 附錄62

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

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本文編號：823825