本文關(guān)鍵詞：韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶BoGSTd1和BoGSTd2基因的克隆及特性研究

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【摘要】：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferases,GSTs,EC 2.5.1.18)是一類廣泛分布于動(dòng)植物、微生物等有機(jī)體內(nèi)的多功能酶。GSTs主要功能是代謝生物體內(nèi)的有毒物質(zhì),從而避免或降低機(jī)體受到損傷,與昆蟲(chóng)的抗藥性相關(guān)。韭菜遲眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga Yang et Zhang)是韭菜等百合科蔬菜上的重要害蟲(chóng),主要以幼蟲(chóng)聚集在韭菜地下鱗莖處進(jìn)行取食危害。目前,生產(chǎn)上主要采用化學(xué)農(nóng)藥灌根進(jìn)行防治,造成韭菜農(nóng)藥殘留超標(biāo),食物中毒事件頻發(fā)。由于化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用導(dǎo)致該蟲(chóng)的抗藥性增強(qiáng),給防治工作帶來(lái)困難。本研究對(duì)韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行克隆、表達(dá)并初步分析其功能,有助于了解韭菜遲眼蕈蚊抗性形成的分子機(jī)制,為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中韭菜遲眼蕈蚊的防治提供理論依據(jù)。本研究主要結(jié)果如下:1.韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因克隆與生物信息學(xué)分析利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得兩個(gè)韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因,即BoGSTd1和BoGSTd2。BoGSTd1開(kāi)放閱讀框?yàn)?36bp,編碼211個(gè)氨基酸,其等電點(diǎn)和蛋白分子量大小分別為5.94和23.72kDa。BoGSTd2開(kāi)放閱讀框?yàn)?42bp,編碼213個(gè)氨基酸,其等電點(diǎn)和蛋白分子量大小分別為5.12和23.78kDa。通過(guò)序列對(duì)比以及系統(tǒng)發(fā)育分析可知,兩個(gè)基因均為Delta家族的GSTs基因。兩者均無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)并且兩個(gè)基因組DNA均不包含內(nèi)含子。BoGSTd1和BoGSTd2氨基酸序列相似性為55.61%。2.韭菜遲眼蕈蚊BoGSTd1和BoGSTd2時(shí)空表達(dá)利用Real-time PCR技術(shù)測(cè)定不同發(fā)育時(shí)期和不同組織BoGSTd1和BoGSTd2的表達(dá)量。結(jié)果顯示,韭菜遲眼蕈蚊BoGSTd1和BoGSTd2在其發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),BoGSTd1在卵期表達(dá)量最高,三、四齡幼蟲(chóng)表達(dá)量次之,一、二齡幼蟲(chóng)和蛹期表達(dá)量相對(duì)較少。BoGSTd2則在卵期表達(dá)量最高,其余各個(gè)時(shí)期表達(dá)量差異不顯著。BoGSTd1和BoGSTd2在不同組織中表達(dá)量存在顯著差異。BoGSTd1和BoGSTd2在成蟲(chóng)體內(nèi)的分布較為相似,在腹部表達(dá)量最高,頭部和胸部次之,其他組織中表達(dá)量很少甚至不表達(dá)。3.韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶原核表達(dá)及活性測(cè)定利用原核表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)并純化獲得大小約為25kDa的可溶性體外重組蛋白BoGSTd1和BoGSTd2。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定其濃度,結(jié)果顯示,BoGSTd1和BoGSTd2體外重組蛋白的濃度分別為37.29 mg/ml和21.25 mg/ml。SDS-PAGE結(jié)果表明,兩個(gè)純化后的重組蛋白具有較高的純度。以CDNB和GSH為底物,測(cè)定其活性,結(jié)果表明兩個(gè)重組蛋白均能催化GSH與CDNB發(fā)生共軛反應(yīng),BoGSTd1最大反應(yīng)速率Vmax為1062±60.84μmol/mg/min,米氏常數(shù)Km為0.35±0.05 mM,BoGSTd2動(dòng)力學(xué)常數(shù)Vmax和Km分別為290.4±11.42μmol/mg/min和0.24±0.02 mM。GSTs在不同的pH值和溫度條件下表現(xiàn)出的活性也存在差異,BoGSTd1和BoGSTd2都表現(xiàn)出隨緩沖液pH值的升高活性先升高隨后降低的趨勢(shì)。BoGSTd1在pH約為8.0-8.5時(shí)活性最高,而B(niǎo)oGSTd2在緩沖液pH約為7時(shí)活性最高。體外重組蛋白BoGSTd1和BoGSTd2在40℃以下時(shí),均表現(xiàn)出較高的活性。4.殺蟲(chóng)劑對(duì)酶活性的影響測(cè)定了三種殺蟲(chóng)劑對(duì)兩個(gè)重組蛋白活性的影響。結(jié)果顯示,濃度為0.25 mM的甲基毒死蜱、高效氯氟氰菊酯、西維因處理后,BoGSTd1和Bo GSTd2活性均顯著下降。其中甲基毒死蜱對(duì)酶活性的抑制作用最為明顯,BoGSTd1和BoGSTd2殘留酶活僅為11.7%和5.44%。測(cè)定了上述藥劑對(duì)BoGSTd1和BoGSTd2酶活性的抑制中濃度(IC50)。結(jié)果顯示,隨著藥劑濃度的增加,BoGSTd1酶活性逐漸降低。甲基毒死蜱、高效氯氟氰菊酯和西維因?qū)oGSTd1的IC50分別為0.19 mM、0.21m M和0.22 mM。隨著藥劑濃度的增加,BoGSTd2活性先逐漸增大然后減小直至完全被抑制。當(dāng)甲基毒死蜱、高效氯氟氰菊酯和西維因濃度分別達(dá)到0.25 mM、0.3125 mM和0.3125 mM時(shí),BoGSTd2活性被完全抑制。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶抑制劑馬來(lái)酸二乙酯顯著地抑制了BoGSTd1和BoGSTd2活性,隨著抑制劑濃度的升高蛋白活性逐漸降低,馬來(lái)酸二乙酯對(duì)重組蛋白BoGSTd1和BoGSTd2的抑制中濃IC50分別為0.041 mM和0.038 mM。
【關(guān)鍵詞】：韭菜遲眼蕈蚊 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 原核表達(dá) 酶活測(cè)定
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S436.33
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-18
• 1.1 韭菜遲眼蕈蚊概述11-12
• 1.1.1 韭菜遲眼蕈蚊生活習(xí)性及發(fā)生規(guī)律11
• 1.1.2 環(huán)境因子對(duì)韭菜遲眼蕈蚊的影響11-12
• 1.1.3 韭菜遲眼蕈蚊的防治12
• 1.2 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的概述12-17
• 1.2.1 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的分類及命名13
• 1.2.2 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)13-14
• 1.2.3 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的功能14-17
• 1.3 研究的目的和意義17-18
• 第二章 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及表達(dá)分析18-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備18-19
• 2.1.1 供試?yán)ハx(chóng)18
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器18
• 2.1.3 試劑18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-27
• 2.2.1 總RNA的提取19
• 2.2.2 cDNA第一鏈的合成19-20
• 2.2.3 RACE模板的制備20-21
• 2.2.4 韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因克隆21-24
• 2.2.5 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因內(nèi)含子的分析24-25
• 2.2.6 生物信息學(xué)分析25
• 2.2.7 韭菜遲眼蕈蚊BoGSTd1和BoGSTd2時(shí)空表達(dá)25-27
• 2.3 結(jié)果與分析27-38
• 2.3.1 韭菜遲眼蕈蚊總RNA的提取27
• 2.3.2 韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶保守區(qū)克隆27
• 2.3.3 韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶RACE片段克隆27
• 2.3.4 韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因全長(zhǎng)cDNA的克隆27-28
• 2.3.5 序列分析28-30
• 2.3.6 韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶內(nèi)含子分析30
• 2.3.7 生物信息學(xué)分析30-33
• 2.3.8 系統(tǒng)發(fā)育分析33-35
• 2.3.9 韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)分析35-38
• 2.4 討論38-40
• 第三章 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶原核表達(dá)及功能分析40-53
• 3.1 材料與儀器設(shè)備40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法40-45
• 3.2.1 GSTs開(kāi)放閱讀框的獲得40-41
• 3.2.2 pMD-BoGSTd1、pMD-BoGSTd2和pET-28a(+)質(zhì)粒的提取41
• 3.2.3 pMD-BoGSTd1、pMD-BoGSTd2和pET-28a(+)質(zhì)粒雙酶切41-42
• 3.2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建42-43
• 3.2.5 酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定43-44
• 3.2.6 不同pH和溫度對(duì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力的影響44
• 3.2.7 殺蟲(chóng)劑對(duì)酶活力的影響44-45
• 3.3 結(jié)果與分析45-50
• 3.3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建45
• 3.3.2 重組蛋白的表達(dá)與純化45-47
• 3.3.3 重組蛋白酶動(dòng)力學(xué)特性47
• 3.3.4 pH和溫度對(duì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力的影響47-48
• 3.3.5 藥劑對(duì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響48-50
• 3.4 討論50-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 致謝60-61
• 個(gè)人簡(jiǎn)介61

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張琪;韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶BoGSTd1和BoGSTd2基因的克隆及特性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：814426