本文關(guān)鍵詞：韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶BoGSTd1和BoGSTd2基因的克隆及特性研究

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【摘要】：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferases,GSTs,EC 2.5.1.18)是一類廣泛分布于動植物、微生物等有機體內(nèi)的多功能酶。GSTs主要功能是代謝生物體內(nèi)的有毒物質(zhì),從而避免或降低機體受到損傷,與昆蟲的抗藥性相關(guān)。韭菜遲眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga Yang et Zhang)是韭菜等百合科蔬菜上的重要害蟲,主要以幼蟲聚集在韭菜地下鱗莖處進(jìn)行取食危害。目前,生產(chǎn)上主要采用化學(xué)農(nóng)藥灌根進(jìn)行防治,造成韭菜農(nóng)藥殘留超標(biāo),食物中毒事件頻發(fā)。由于化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用導(dǎo)致該蟲的抗藥性增強,給防治工作帶來困難。本研究對韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行克隆、表達(dá)并初步分析其功能,有助于了解韭菜遲眼蕈蚊抗性形成的分子機制,為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中韭菜遲眼蕈蚊的防治提供理論依據(jù)。本研究主要結(jié)果如下:1.韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因克隆與生物信息學(xué)分析利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得兩個韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因,即BoGSTd1和BoGSTd2。BoGSTd1開放閱讀框為636bp,編碼211個氨基酸,其等電點和蛋白分子量大小分別為5.94和23.72kDa。BoGSTd2開放閱讀框為642bp,編碼213個氨基酸,其等電點和蛋白分子量大小分別為5.12和23.78kDa。通過序列對比以及系統(tǒng)發(fā)育分析可知,兩個基因均為Delta家族的GSTs基因。兩者均無信號肽和跨膜區(qū)并且兩個基因組DNA均不包含內(nèi)含子。BoGSTd1和BoGSTd2氨基酸序列相似性為55.61%。2.韭菜遲眼蕈蚊BoGSTd1和BoGSTd2時空表達(dá)利用Real-time PCR技術(shù)測定不同發(fā)育時期和不同組織BoGSTd1和BoGSTd2的表達(dá)量。結(jié)果顯示,韭菜遲眼蕈蚊BoGSTd1和BoGSTd2在其發(fā)育的各個時期均有表達(dá),BoGSTd1在卵期表達(dá)量最高,三、四齡幼蟲表達(dá)量次之,一、二齡幼蟲和蛹期表達(dá)量相對較少。BoGSTd2則在卵期表達(dá)量最高,其余各個時期表達(dá)量差異不顯著。BoGSTd1和BoGSTd2在不同組織中表達(dá)量存在顯著差異。BoGSTd1和BoGSTd2在成蟲體內(nèi)的分布較為相似,在腹部表達(dá)量最高,頭部和胸部次之,其他組織中表達(dá)量很少甚至不表達(dá)。3.韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶原核表達(dá)及活性測定利用原核表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)并純化獲得大小約為25kDa的可溶性體外重組蛋白BoGSTd1和BoGSTd2。用BCA蛋白定量試劑盒測定其濃度,結(jié)果顯示,BoGSTd1和BoGSTd2體外重組蛋白的濃度分別為37.29 mg/ml和21.25 mg/ml。SDS-PAGE結(jié)果表明,兩個純化后的重組蛋白具有較高的純度。以CDNB和GSH為底物,測定其活性,結(jié)果表明兩個重組蛋白均能催化GSH與CDNB發(fā)生共軛反應(yīng),BoGSTd1最大反應(yīng)速率Vmax為1062±60.84μmol/mg/min,米氏常數(shù)Km為0.35±0.05 mM,BoGSTd2動力學(xué)常數(shù)Vmax和Km分別為290.4±11.42μmol/mg/min和0.24±0.02 mM。GSTs在不同的pH值和溫度條件下表現(xiàn)出的活性也存在差異,BoGSTd1和BoGSTd2都表現(xiàn)出隨緩沖液pH值的升高活性先升高隨后降低的趨勢。BoGSTd1在pH約為8.0-8.5時活性最高,而BoGSTd2在緩沖液pH約為7時活性最高。體外重組蛋白BoGSTd1和BoGSTd2在40℃以下時,均表現(xiàn)出較高的活性。4.殺蟲劑對酶活性的影響測定了三種殺蟲劑對兩個重組蛋白活性的影響。結(jié)果顯示,濃度為0.25 mM的甲基毒死蜱、高效氯氟氰菊酯、西維因處理后,BoGSTd1和Bo GSTd2活性均顯著下降。其中甲基毒死蜱對酶活性的抑制作用最為明顯,BoGSTd1和BoGSTd2殘留酶活僅為11.7%和5.44%。測定了上述藥劑對BoGSTd1和BoGSTd2酶活性的抑制中濃度(IC50)。結(jié)果顯示,隨著藥劑濃度的增加,BoGSTd1酶活性逐漸降低。甲基毒死蜱、高效氯氟氰菊酯和西維因?qū)oGSTd1的IC50分別為0.19 mM、0.21m M和0.22 mM。隨著藥劑濃度的增加,BoGSTd2活性先逐漸增大然后減小直至完全被抑制。當(dāng)甲基毒死蜱、高效氯氟氰菊酯和西維因濃度分別達(dá)到0.25 mM、0.3125 mM和0.3125 mM時,BoGSTd2活性被完全抑制。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶抑制劑馬來酸二乙酯顯著地抑制了BoGSTd1和BoGSTd2活性,隨著抑制劑濃度的升高蛋白活性逐漸降低,馬來酸二乙酯對重組蛋白BoGSTd1和BoGSTd2的抑制中濃IC50分別為0.041 mM和0.038 mM。
【關(guān)鍵詞】：韭菜遲眼蕈蚊 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 原核表達(dá) 酶活測定
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.33
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-18
• 1.1 韭菜遲眼蕈蚊概述11-12
• 1.1.1 韭菜遲眼蕈蚊生活習(xí)性及發(fā)生規(guī)律11
• 1.1.2 環(huán)境因子對韭菜遲眼蕈蚊的影響11-12
• 1.1.3 韭菜遲眼蕈蚊的防治12
• 1.2 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的概述12-17
• 1.2.1 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的分類及命名13
• 1.2.2 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)13-14
• 1.2.3 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的功能14-17
• 1.3 研究的目的和意義17-18
• 第二章 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及表達(dá)分析18-40
• 2.1 實驗材料與儀器設(shè)備18-19
• 2.1.1 供試?yán)ハx18
• 2.1.2 實驗儀器18
• 2.1.3 試劑18-19
• 2.2 實驗方法19-27
• 2.2.1 總RNA的提取19
• 2.2.2 cDNA第一鏈的合成19-20
• 2.2.3 RACE模板的制備20-21
• 2.2.4 韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因克隆21-24
• 2.2.5 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因內(nèi)含子的分析24-25
• 2.2.6 生物信息學(xué)分析25
• 2.2.7 韭菜遲眼蕈蚊BoGSTd1和BoGSTd2時空表達(dá)25-27
• 2.3 結(jié)果與分析27-38
• 2.3.1 韭菜遲眼蕈蚊總RNA的提取27
• 2.3.2 韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶保守區(qū)克隆27
• 2.3.3 韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶RACE片段克隆27
• 2.3.4 韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因全長cDNA的克隆27-28
• 2.3.5 序列分析28-30
• 2.3.6 韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶內(nèi)含子分析30
• 2.3.7 生物信息學(xué)分析30-33
• 2.3.8 系統(tǒng)發(fā)育分析33-35
• 2.3.9 韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)分析35-38
• 2.4 討論38-40
• 第三章 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶原核表達(dá)及功能分析40-53
• 3.1 材料與儀器設(shè)備40
• 3.2 實驗方法40-45
• 3.2.1 GSTs開放閱讀框的獲得40-41
• 3.2.2 pMD-BoGSTd1、pMD-BoGSTd2和pET-28a(+)質(zhì)粒的提取41
• 3.2.3 pMD-BoGSTd1、pMD-BoGSTd2和pET-28a(+)質(zhì)粒雙酶切41-42
• 3.2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建42-43
• 3.2.5 酶動力學(xué)常數(shù)的測定43-44
• 3.2.6 不同pH和溫度對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力的影響44
• 3.2.7 殺蟲劑對酶活力的影響44-45
• 3.3 結(jié)果與分析45-50
• 3.3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建45
• 3.3.2 重組蛋白的表達(dá)與純化45-47
• 3.3.3 重組蛋白酶動力學(xué)特性47
• 3.3.4 pH和溫度對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力的影響47-48
• 3.3.5 藥劑對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響48-50
• 3.4 討論50-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 致謝60-61
• 個人簡介61

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張琪;韭菜遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶BoGSTd1和BoGSTd2基因的克隆及特性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

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本文編號：814426