發(fā)布時(shí)間：2017-09-07 04:11

  本文關(guān)鍵詞：辣椒素合成結(jié)構(gòu)基因及MYB轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能驗(yàn)證

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【摘要】：辣椒素(Capsaicin)作為一類只在辣椒屬植物中合成的次生代謝產(chǎn)物,是辣椒(Capsicum spp.)果實(shí)品質(zhì)的重要部分。雖然“涮涮辣”是辣椒素含量極高的中國(guó)辣椒(Capsicum chinense Jacquin)品種,但是其坐果率低,生長(zhǎng)周期長(zhǎng),抗病性差,產(chǎn)量低,不便用于辣椒素生產(chǎn)的原料品種,因此挖掘參與調(diào)控辣椒素合成的關(guān)鍵基因或轉(zhuǎn)錄因子,弄清他們的作用機(jī)制,既有利于理解辣椒素積累的分子機(jī)理,又有利于提供調(diào)控辣椒素含量的供體基因,以便于將高辣椒素基因轉(zhuǎn)到經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的品種中。盡管目前對(duì)辣椒生物合成途徑中的關(guān)鍵基因的研究已取得了重要進(jìn)展,但不同辣度材料結(jié)構(gòu)基因、啟動(dòng)子之間是否存在差異,受到哪些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控還尚未弄清。AT3只在有辣味的辣椒中表達(dá),辣椒素只在胎座中合成,合成途徑相同辣度卻存在著差異,表達(dá)的時(shí)空特異性暗示了AT3的重要性以及其合成途徑受到轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的可能性。本研究通過對(duì)三種不同辣度的辣椒素合成重要結(jié)構(gòu)基因的克隆及表達(dá)量進(jìn)行分析,找出了重要的結(jié)構(gòu)基因AMT、AT3;對(duì)“涮涮辣”AT3啟動(dòng)子進(jìn)行活性分析,發(fā)現(xiàn)一些增強(qiáng)區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控元件;并且對(duì)可能調(diào)控它的MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行初步驗(yàn)證。取得的研究結(jié)果如下:1、由于辣椒素只在胎座中合成,所以對(duì)高辣辣椒“740”(“涮涮辣”)、中辣辣椒“59”以及無辣甜椒“170”胎座的RNA進(jìn)行提取,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,克隆9個(gè)重要的辣椒素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因,利用生物信息學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行序列比對(duì)分析,并對(duì)果肉和胎座中的表達(dá)量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)AMT和AT3在果肉和胎座的表達(dá)量有明顯差異,AT3在甜椒中出現(xiàn)大片段的缺失,沒有起始密碼子,不能合成AT3酶,由此可知AMT和AT3在辣椒素合成過程中具有重要作用。2、選擇AT3和AMT兩個(gè)基因,構(gòu)建VIGS表達(dá)載體,對(duì)其進(jìn)行沉默,在花后16天采集辣椒胎座,進(jìn)行表達(dá)量分析,胎座中的AT3和AMT表達(dá)量顯著下降,花后45天采集胎座進(jìn)行辣椒素含量測(cè)定,發(fā)現(xiàn)AMT的辣椒素含量下降了25%,AT3沉默植株的辣椒素含量幾乎沒有變化。3、前期研究表明,有大量MYB轉(zhuǎn)錄因子在胎座中顯著上調(diào)表達(dá),暗示著AT3可能受MYB轉(zhuǎn)錄調(diào)控,對(duì)“740”的AT3 5’端上游1889bp啟動(dòng)子進(jìn)行分析,找出其可能的MYB結(jié)合位點(diǎn),以不破壞MYB結(jié)合位點(diǎn)為原則,構(gòu)建了5個(gè)5’端缺失表達(dá)載體,采用PEG融合進(jìn)入辣椒胎座原生質(zhì)體中,通過熒光顯微鏡進(jìn)行熒光觀察,找出了747bp的活性區(qū)域,再以此活性區(qū)域?yàn)槟０?構(gòu)建5個(gè)中間缺失表達(dá)載體,導(dǎo)入辣椒胎座原生質(zhì)體中,通過熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè),最終確定了237bp的活性區(qū)域,該區(qū)域含有兩個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),故而推測(cè)其受MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。4、以“740”cDNA為模板,參照辣椒基因組序列,克隆出了CcMYB86、CcMYB2、CcMYB48、CcMYB59,并進(jìn)行表達(dá)量的分析,發(fā)現(xiàn)除CcMYB86外,CcMYB2、CcMYB48、CcMYB59在胎座中的表達(dá)量都明顯高于果肉。5、轉(zhuǎn)錄因子行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控需要在細(xì)胞核中才能進(jìn)行,對(duì)CcMYB86、CcMYB2、CcMYB48、CcMYB59序列分析表明其都具有保守的R2R3結(jié)構(gòu)域,屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族,且亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其都屬于核定位。6、將CcMYB86、CcMYB2、CcMYB48、CcMYB59構(gòu)建到pTRV2載體中,用VIGS手段將其沉默,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在沉默植株中,CcMYB86、CcMYB2、CcMYB59在胎座中的表達(dá)量顯著下調(diào),辣椒素合成相關(guān)基因BCAT、COMT、AMT、AT3的表達(dá)量也發(fā)生了顯著的變化,采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)辣椒素含量進(jìn)行測(cè)量,發(fā)現(xiàn)辣椒素含量也下調(diào)了。說明這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子都參與了辣椒素的合成調(diào)控,并且BCAT、COMT、AMT、AT3都受上述3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：“涮涮辣” 辣椒素 結(jié)構(gòu)基因 啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄因子
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S641.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮略詞表(Abbreviation)7-9
• 氨基酸簡(jiǎn)寫符號(hào)9-12
• 1 前言12-22
• 1.1 研究背景12-20
• 1.1.1 辣椒素的合成途徑及相關(guān)基因的研究13-15
• 1.1.2 啟動(dòng)子簡(jiǎn)介15-17
• 1.1.3 轉(zhuǎn)錄因子概述17-20
• 1.2 本研究的目的和意義20-22
• 2 材料與方法22-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-38
• 2.2.1 辣椒DNA的提取22-23
• 2.2.2 辣椒胎座與果肉RNA分離與質(zhì)量檢測(cè)23
• 2.2.3 cDNA第一鏈的合成23-24
• 2.2.4 基因全長(zhǎng)的克隆與測(cè)序24-26
• 2.2.5 PCR產(chǎn)物回收26
• 2.2.6 回收片段的連接26
• 2.2.7 用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)26-27
• 2.2.8 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)27
• 2.2.9 質(zhì)粒DNA提取27-28
• 2.2.10 農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備28-29
• 2.2.11 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的方法29
• 2.2.12 qRT-PCR檢測(cè)29-31
• 2.2.13 生物信息學(xué)分析31
• 2.2.14 啟動(dòng)子活性分析31-33
• 2.2.15 辣椒胎座原生質(zhì)體的制備及PEG誘導(dǎo)的融合33-34
• 2.2.16 亞細(xì)胞定位34-35
• 2.2.17 病毒誘導(dǎo)基因沉默35-37
• 2.2.18 辣椒素含量測(cè)定方法37-38
• 3 結(jié)果與分析38-61
• 3.1 九個(gè)辣椒素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因cDNA克隆與表達(dá)量分析38-53
• 3.1.1 ACL分析38-39
• 3.1.2 BCAT分析39-40
• 3.1.3 FatA分析40-41
• 3.1.4 C4H分析41-42
• 3.1.5 COMT分析42-43
• 3.1.6 PAL分析43-44
• 3.1.7 AMT分析44-45
• 3.1.8 KAS分析45-46
• 3.1.9 AT3分析46-51
• 3.1.10 AT3和AMT基因沉默51-53
• 3.2 AT3啟動(dòng)子活性分析53-55
• 3.3 MYB轉(zhuǎn)錄因子克隆和功能驗(yàn)證55-61
• 3.3.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析55-57
• 3.3.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子在辣椒胎座和果肉中的表達(dá)量分析57
• 3.3.3 MYB轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位結(jié)果57-58
• 3.3.4 MYB轉(zhuǎn)錄因子的沉默58-61
• 4 討論61-65
• 4.1 涮涮辣61
• 4.2 結(jié)構(gòu)基因?qū)苯匪睾铣傻挠绊?/span>61-62
• 4.3 啟動(dòng)子活性分析62-63
• 4.4 MYB轉(zhuǎn)錄因子與辣椒素合成結(jié)構(gòu)基因間的關(guān)系63-65
• 5 結(jié)論65-66
• 致謝66-67
• 參考文獻(xiàn)67-73
• 附錄A 結(jié)構(gòu)基因序列比對(duì)結(jié)果73-86

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：807330