本文關(guān)鍵詞：高產(chǎn)堿性蛋白酶基因工程菌構(gòu)建、表達(dá)與其粗酶微膠囊化研究

  更多相關(guān)文章： 堿性蛋白酶 基因重組 發(fā)酵優(yōu)化 微膠囊

【摘要】：本研究隸屬于國家十二五技術(shù)攻關(guān)項目-《食源性功能肽生物制備技術(shù)研究》(2012BAD33B03)。以地衣芽孢桿菌2709為堿性蛋白酶基因來源,借助PCR技術(shù)、SDS-PAGE技術(shù)、Image J軟件分析技術(shù)、8-395 Pro儀器微膠囊包埋技術(shù)等手段,采用單因素實驗設(shè)計和響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計等研究方法,創(chuàng)新性地開展了重組菌E.coli Top 10-p GM-T-Apr的構(gòu)建與鑒定,重組菌E.coli BL21-p ET-28b(+)-Apr的構(gòu)建與鑒定,重組菌E.coli BL21-p ET-28b(+)-Apr的發(fā)酵優(yōu)化,基于微膠囊技術(shù)固定堿性蛋白酶及酶特性研究等四個方面的研究內(nèi)容,成功構(gòu)建了一種單位菌密度高產(chǎn)堿性蛋白酶的重組菌E.coli BL21-p ET-28b(+)-Apr,確定了該重組菌以酶活性、葡萄糖利用率及菌密度為指標(biāo)的發(fā)酵條件,并初步揭示了微膠囊化的粗酶有效延長了酶活半衰期,適宜條件更為溫和,為后期開展堿性蛋白酶工業(yè)化生產(chǎn)相關(guān)研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。本研究所獲成果如下:(1)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)計可行引物,引入Nco I和Xho I酶切位點,經(jīng)過優(yōu)化PCR條件,確定最佳退火溫度,擴(kuò)增堿性蛋白酶目的基因Apr,其中包括開放閱讀框和完整的上下游調(diào)控區(qū)�；厥漳康钠�,連接p GM-T載體,成功構(gòu)建重組菌E.coli Top 10-p GM-T-Apr,進(jìn)行FD.Xho I和FD.Nco I酶切鑒定,擴(kuò)增序列大小與預(yù)期一致。(2)將鑒定正確的Apr基因序列經(jīng)FD.Xho I和FD.Nco I酶切純化回收后,插入至表達(dá)載體p ET-28b(+)中,成功構(gòu)建重組原核表達(dá)載體p ET-28b(+)-Apr。p ET-28b(+)-Apr轉(zhuǎn)化至E.coli Top 10中,進(jìn)行質(zhì)粒提取并送生物公司進(jìn)行測序,軟件分析得出同源性高達(dá)98%。重組原核表達(dá)載體p ET-28b(+)-Apr轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中,經(jīng)SDS-PAGE分析表明,目的基因Apr在E.coli BL21中表達(dá)蛋白分子量約為36 k Da。(3)以葡萄糖濃度、蛋白胨濃度、鹽溶液體積、培養(yǎng)時間和震蕩速率為變量進(jìn)行重組菌發(fā)酵單因素實驗,綜合三項指標(biāo)確定顯著因素和最優(yōu)水平。基于單因素實驗確定蛋白胨濃度、培養(yǎng)時間和震蕩速率為變量進(jìn)行響應(yīng)面實驗,獲得重組菌發(fā)酵統(tǒng)計模型,綜合三項指標(biāo)確定最佳工藝參數(shù)為:蛋白胨濃度8.1 g/L,培養(yǎng)時間24 h 15 min,振蕩速率180 r/min。在單位菌密度的條件下,重組菌的蛋白酶活性顯著高于原始菌株;同時,葡萄糖的利用量與原始菌株并無顯著差異,重組菌在工業(yè)應(yīng)用中意義更大。(4)以海藻酸鈉濃度,Ca Cl2濃度,固定時間,堿性蛋白酶濃度為變量,以微膠囊包埋率為指標(biāo)進(jìn)行粗酶微膠囊化單因素實驗,確定響應(yīng)面因素水平中心點�；趩我蛩貙嶒灤_定海藻酸鈉濃度,Ca Cl2濃度,固定時間,堿性蛋白酶濃度為變量進(jìn)行響應(yīng)面實驗,獲得粗酶微膠囊統(tǒng)計模型,確定最佳工藝參數(shù)為:在海藻酸鈉濃度1.47%,無水氯化鈣濃度2.93%,固定時間62 min和堿性蛋白酶濃度0.78%,在此條件下,微膠囊的包封率達(dá)到95.51%。通過對比分析游離堿性蛋白酶與微膠囊水解效果,發(fā)現(xiàn)游離酶與微膠囊在水解最適條件方面略有差異,在水溶液p H與溫度變化中,微膠囊表現(xiàn)更為溫和,通過微膠囊固定化大大延長了堿性蛋白酶的保存時限,在工業(yè)生產(chǎn)中有廣泛應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：堿性蛋白酶 基因重組 發(fā)酵優(yōu)化 微膠囊
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TQ925
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 緒論12-17
• 1.1 堿性蛋白酶的重要應(yīng)用12
• 1.2 微生物堿性蛋白酶研究進(jìn)展12-14
• 1.2.1 生產(chǎn)菌株及構(gòu)建方法研究現(xiàn)狀12-13
• 1.2.2 菌株發(fā)酵優(yōu)化研究現(xiàn)狀13-14
• 1.3 微膠囊固定化技術(shù)研究14-15
• 1.3.1 微膠囊固定化前景概述14
• 1.3.2 微膠囊固定化方法概述14-15
• 1.4 論文研究內(nèi)容15-17
• 1.4.1 研究內(nèi)容15-16
• 1.4.2 研究路線16-17
• 第2章 重組菌E. coli Top 10-pGM-T-Apr的構(gòu)建與鑒定17-26
• 2.1 材料與設(shè)備17-18
• 2.1.1 材料與試劑17
• 2.1.2 儀器與設(shè)備17-18
• 2.2 實驗方法18-23
• 2.2.1 培養(yǎng)基、試劑配制18
• 2.2.2 目的基因Apr的擴(kuò)增與回收18-21
• 2.2.3 質(zhì)粒pGM-T-Apr的構(gòu)建21
• 2.2.4 重組菌E. coli Top 10-pGM-T-Apr的構(gòu)建21-22
• 2.2.5 重組菌E. coli Top 10-pGM-T-Apr的鑒定22-23
• 2.2.6 定量分析核酸電泳23
• 2.3 結(jié)果與分析23-25
• 2.3.1 目的基因Apr的擴(kuò)增與回收研究結(jié)果23-24
• 2.3.2 重組菌E. coli Top 10-pGM-T-Apr的構(gòu)建與鑒定結(jié)果24-25
• 2.4 本章小結(jié)25-26
• 第3章 重組菌E. coli BL21-pET-28b (+)-Apr的構(gòu)建與鑒定26-39
• 3.1 材料與設(shè)備26-27
• 3.1.1 材料與試劑26-27
• 3.1.2 儀器與設(shè)備27
• 3.2 實驗方法27-31
• 3.2.1 培養(yǎng)基、試劑配制27-28
• 3.2.2 目的基因Apr的獲得28
• 3.2.3 質(zhì)粒pET-28b (+)-Apr的構(gòu)建28-30
• 3.2.4 E. coli Top 10-pET-28b (+)-Apr的構(gòu)建與鑒定30
• 3.2.5 重組菌E. coli BL21-pET-28b (+)-Apr的構(gòu)建與鑒定30
• 3.2.6 重組菌蛋白質(zhì)表達(dá)及分析30-31
• 3.3 結(jié)果與分析31-38
• 3.3.1 目的基因Apr的擴(kuò)增與回收研究結(jié)果31-32
• 3.3.2 質(zhì)粒pET-28b (+)-Apr的構(gòu)建研究結(jié)果32-33
• 3.3.3 E. coli Top 10-pET-28b (+)-Apr的構(gòu)建與鑒定33-37
• 3.3.4 重組菌BL21-pET-28b (+)-Apr的構(gòu)建與鑒定結(jié)果37
• 3.3.5 重組菌蛋白質(zhì)表達(dá)及分析結(jié)果37-38
• 3.4 本章小結(jié)38-39
• 第4章 重組菌E. coli BL21-pET-28b (+)-Apr的發(fā)酵優(yōu)化39-59
• 4.1 材料與設(shè)備39-40
• 4.1.1 材料與試劑39
• 4.1.2 儀器與設(shè)備39-40
• 4.2 實驗方法40-43
• 4.2.1 試劑配制40
• 4.2.2 酶活測定方法40-41
• 4.2.3 葡萄糖殘量測定方法建立41
• 4.2.4 菌種生長狀態(tài)方法建立41
• 4.2.5 單因素試驗設(shè)計41-42
• 4.2.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計42-43
• 4.3 結(jié)果與分析43-58
• 4.3.1 單因素實驗結(jié)果43-49
• 4.3.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果49-57
• 4.3.3 重組菌與地衣芽孢桿菌發(fā)酵情況對比分析57-58
• 4.4 本章小結(jié)58-59
• 第5章 基于微膠囊技術(shù)固定堿性蛋白酶及酶特性研究59-72
• 5.1 材料與設(shè)備59
• 5.1.1 材料與試劑59
• 5.1.2 儀器與設(shè)備59
• 5.2 實驗方法59-61
• 5.2.1 粗酶的純度59-60
• 5.2.2 微膠囊包埋率方法建立60
• 5.2.3 單因素實驗設(shè)計60
• 5.2.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計60-61
• 5.2.5 微膠囊特性分析61
• 5.3 結(jié)果與分析61-71
• 5.3.1 粗酶純度測定61
• 5.3.2 單因素實驗結(jié)果61-64
• 5.3.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果64-68
• 5.3.4 微膠囊特性分析結(jié)果68-71
• 5.4 本章小結(jié)71-72
• 第6章 結(jié)論72-74
• 6.1 全文結(jié)論72-73
• 6.2 創(chuàng)新點73-74
• 參考文獻(xiàn)74-83
• 導(dǎo)師簡介83-85
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果85-87
• 致謝87

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本文編號：806165