本文關鍵詞：差異基因表達譜分析小鼠燒傷早期刺激反應相關基因靶標

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【摘要】：研究背景燒傷,尤其是大面積燒傷后大量組織壞死、明顯的應激、休克、感染和營養(yǎng)缺乏等反應,與后續(xù)的各種治療因素一起改變了機體免疫細胞和免疫分子所處的微環(huán)境,引起機體發(fā)生一系列的免疫學及病理生理學變化,以至于機體免疫功能紊亂的發(fā)生。隨著燒傷免疫功能紊亂(post burn immune dysfunction,PID)觀點的提出,燒傷免疫功能紊亂被認為是燒傷后引發(fā)嚴重感染、多器官系統(tǒng)功能紊亂甚至死亡的重要原因。雖然不斷發(fā)展的燒傷治療技術一定程度上改善了患暫的預后,但嚴重燒傷患哲死亡率并未見明濕降低,無法得到根本改善的燒傷后免疫功能紊亂被認為是其主要的障礙。目前對于燒傷免疫方面的研究多是對免疫細胞(包括T細胞、B細胞、殺傷細胞和單核巨噬細胞等)、免疫因子(如TNF、IL-1和IL-6等)的作用機制或細胞凋亡、細胞死亡、感染和器官損傷等方面的研究,由于從單一的基因及因子的研究出發(fā)時很難解釋整個細胞或系統(tǒng)的變化的,因此我們需要從整體基因組層次全面了解燒傷后免疫功能的紊亂�；蛐酒夹g和生物信息學技術的出現(xiàn)為此提供了可能,它從轉(zhuǎn)錄水平和DNA層面來了解燒傷后機體發(fā)生的病理生理學變化過程。生物領域的新技術(基因芯片、生物信息學)、新的研究方法(功能基因組學、蛋白組學)在臨床中逐步得到應用,更新了醫(yī)學科學基礎。另外,醫(yī)療實踐以循證醫(yī)學為主,從基因、蛋白質(zhì)等大分子水平研究疾病的發(fā)病機制,對疾病進行預防、診斷和治療,目標是向特異性診斷、個性化治療發(fā)展。分子水平生物信息監(jiān)測設備(基因芯片、質(zhì)譜儀等)將成為醫(yī)療領域的新需求。此外,伴隨著生物信息學的飛速發(fā)展,出現(xiàn)了大量潛在的生物標記,其中一些可以用于疾病診斷和治療,這些生物標記物信息在臨床上應用潛力是巨大的。如何將生物標記物應用于臨床診斷、疾病風險評估與開發(fā)新的藥物靶點等是研究的重點問題。2008年有關研究者利用生物信息學和基因芯片技術對創(chuàng)傷和燒傷后小鼠免疫細胞基因組分析中發(fā)現(xiàn)燒傷后可引起免疫系統(tǒng)和炎癥反應等多方面的變化。2010年Lars H. Evers,Dhaval Bhavsar等人又已經(jīng)提出基因芯片從細胞整體基因組水平出發(fā),能為燒傷后免疫功能紊亂機制的研究提供新的思路及治療靶點。目前生物信息學技術和基因芯片技術應用于燒傷方面已比較普遍,但研究大多是從實驗出發(fā)分析某一個細胞因子的基因表達情況,芯片所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)并未得到更好的利用,數(shù)據(jù)分析還處于初級階段的功能驗證分析,因此,目前需要對燒傷基因芯片所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)進行更深入的生物信息學方面數(shù)據(jù)的挖掘和分析,以期為燒傷診斷及治療尋找相關生物靶標。本課題組在前期通過對GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中一組小鼠燒傷后白細胞基因芯片的數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)燒傷后小鼠白細胞表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)過程、細胞過程、代謝過程、應對刺激反應等方面的紊亂,同時也證實了燒傷后免疫系統(tǒng)功能變化一直貫穿著燒傷的全程,其中在燒傷后第1天基因表達變化最為顯著,因此嚴重燒傷后的異常病理生理變化、并發(fā)癥的出現(xiàn)、不良預后的發(fā)生,可能取決于傷后早期機體對燒傷刺激信號的反應。為此本實驗應用生物信息學方法對小鼠燒傷后免疫細胞基因芯片數(shù)據(jù)進行進一步分析,篩選出燒傷后小鼠應對刺激反應過程中的差異表達基因,并分析差異基因的生物學特性,后續(xù)再通過動物實驗對所篩選差異基因進行驗證,以期了解燒傷后免疫細胞應對燒傷刺激反應變化過程的分子機制,為臨床上燒傷早期診斷及藥物治療靶點的篩選提供新方向。本實驗包括兩個部分：第一部分小鼠燒傷早期刺激反應相關基因靶標的篩選[研究目的]利用生物信息學方法對小鼠燒傷早期免疫細胞差異基因表達譜進行分析,以期對小鼠燒傷后免疫細胞應對刺激反應過程的機制加以了解,為篩選出燒傷早期應對刺激反應相關治療靶標。[研究方法]1.基因芯片數(shù)據(jù)篩選：從NCBI的GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ge o/)進行基因芯片樣本篩選,樣本需滿足以下篩選條件：①燒傷動物模型,TBSA20%,Ⅲ度燒傷或燙傷；②燒傷或燙傷分組時間少于48小時；③樣本及對照數(shù)目大于3。最終經(jīng)過芯片質(zhì)量評估,歸類整理后發(fā)現(xiàn),由Lederer JA等提交的GSE7404(動物模型為小鼠,25%TBSA,Ⅲ度燒傷)數(shù)據(jù)集滿足以上篩選條件。我們從中選取燒傷后第1天組免疫細胞樣本數(shù)據(jù)進行分析,總共有8個樣本符合條件,其中4個為燒傷組,4個為對照組。本研究所需GSE7404數(shù)據(jù)是GPL 1261平臺Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array基因芯片,為全血游離白細胞基因芯片。2.基因芯片數(shù)據(jù)的處理：由于基因芯片平臺的差異、系統(tǒng)誤差的存在和后期計算的需要,我們對基因芯片數(shù)據(jù)進行分析之前,需要先進行預處理(pre-procession)。預處理的過程主要包括：數(shù)據(jù)過濾,去除異常數(shù)據(jù)和噪音數(shù)據(jù)；補缺失值,保證數(shù)據(jù)的完整性；對數(shù)轉(zhuǎn)換,以滿足正態(tài)分布的分析要求；標準化,糾正系統(tǒng)誤差,以發(fā)現(xiàn)真正的生物學變異。3.功能富集分析：在本次研究中,我們應用GO-function數(shù)據(jù)包對基因進行功能注釋,以有效的處理GO功能中的冗余,使分析結(jié)果更加可靠精確。應用DAVID數(shù)據(jù)庫(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)對基因數(shù)據(jù)進行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因與基因組百科全書)是由日本京都大學和東京大學聯(lián)合開發(fā)的數(shù)據(jù)庫,KEGG通路富集分析是目前常被使用的芯片數(shù)據(jù)基因功能分析方法,它利用的數(shù)據(jù)是一些已經(jīng)研究清楚的基因之間的相互作用,即就是生物通路。本研究通過DAV ID數(shù)據(jù)庫所篩選刺激反應相關差異基因,并選取刺激反應相關差異基因進行KEGG通路富集分析后,選取與燒傷后免疫細胞刺激反應相關通路。4.刺激反應相關基因蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建及分析：將選取的免疫系統(tǒng)相關差異基因應用DAVID進行基因ID轉(zhuǎn)換,將轉(zhuǎn)換的差異基因輸入到STRING9.1數(shù)據(jù)庫中,選取交互作用評分大于0.4(中等可信度)的互作關系構(gòu)建刺激反應相關差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(Protein-protein interaction network)。網(wǎng)絡分析及MCL子網(wǎng)絡聚類分析采用生物圖表可視化工具Cytoscape軟件進行.STRING數(shù)據(jù)庫(http://string.embl.de)是一個搜尋已知蛋白質(zhì)之間和預測蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng),它不僅包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間直接的物理的相互作用,而且包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間間接功能的相關性。Cytoscape作為一個開源性網(wǎng)絡分析和可視化數(shù)據(jù)分析軟件,目前它可以將生物分子交互網(wǎng)絡與高通量基因表達數(shù)據(jù)和其他的分子狀態(tài)信息整合建構(gòu)可視化的分子交互作用網(wǎng)絡,并且對大規(guī)模蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間相互作用、蛋白質(zhì)和DNA之間等交互作用的關聯(lián)性進行分析。5.統(tǒng)計分析方法：使用R3.01統(tǒng)計軟件進行芯片數(shù)據(jù)處理和分析,原始數(shù)據(jù)通過RMA(robust multiarray average)背景矯正和四分位數(shù)法歸一化處理后,對數(shù)據(jù)進行匯總從而獲取表達水平數(shù)據(jù)。最后采用配對樣本t檢驗和倍比法(fold-change,FC)獲取差異表達基因,差異基因需同時滿足以下條件：①p-value0.01;②|logFC|2。Gene Ontology(基因本體論)、KEGG通路分析和蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡分析采用超幾何算法和Benjamini-Hochberg法對數(shù)據(jù)進行矯正。[研究結(jié)果]1.基因芯片分析結(jié)果：在燒傷后第一天差異基因進行基因功能本體(GO)分析顯示,共有259個刺激反應相關差異基因被選出,其中上調(diào)基因118個,下調(diào)基因141個。通過KEGG通路富集結(jié)果顯示前10個通路符合閾值要求并被顯著富集。主要為包括免疫系統(tǒng)相關通路(toll樣受體信號通路；B細胞受體信號通路；T細胞受體信號通路等)；細胞過程中的細胞生長與死亡相關通路(p53信號通路；細胞凋亡通路)：環(huán)境信息進程中的信號轉(zhuǎn)導相關通路。其中差異基因富集最多、最顯著的為toll樣受體信號通路。2.刺激反應相關蛋白互作網(wǎng)絡分析：在刺激反應相關蛋白互作網(wǎng)絡圖中共由226個節(jié)點,1232條邊組成,在蛋白互作網(wǎng)絡中位于中心位置并且與其他蛋白或基因具有最大互作關系的蛋白或者基因在生物學過程中具有更重要的意義。在蛋白互作網(wǎng)絡圖中我們發(fā)現(xiàn)Jun(Stress=67)、Stat1(Stress=67)、Bcl2 (Stress=56)、Stat3 (Stress=54)、Tlr2(Stress=47)、Myd88(Stress=45)、Jak2 (Stress=41)、Lck(Stress=40)、Hck (Stress=38)、Ptpn6(Stress=38) 10個基因位于網(wǎng)絡中心,具有最高互作關系。為了篩選出與刺激反應過程相關的重要的節(jié)點基因,我們通過MCL分析方法對原始蛋白互作網(wǎng)絡進行聚類分析,選取力度系數(shù)大于4.0,互作關系大于6的網(wǎng)絡模塊進行下一步分析。我們發(fā)現(xiàn)MCL分析總共有7個子網(wǎng)絡被選出。最后通過蛋白互作網(wǎng)絡分析顯示：Lck(表達下調(diào))、Stat1(表達下調(diào))、Myd88(表達上調(diào))、Stat3(表達上調(diào))和Jun(表達上調(diào))5個基因不僅在原始網(wǎng)絡中具有最大互作關系,而且在MCL網(wǎng)絡模塊中處于中心位置。[研究結(jié)論]通過對小鼠燒傷后一天全血游離白細胞基因芯片分析我們發(fā)現(xiàn)Lck、Stat1、 Myd88、Stat3和Jun基因在燒傷早期應對刺激反應過程中可能發(fā)揮重要的作用,是潛在的生物靶標。第二部分運用熒光定量PCR技術驗證靶標基因[研究目的]通過動物學實驗來驗證小鼠燒傷后刺激反應相關重要靶標基因。[研究方法]動物分組及燙傷模型建立：選取50只健康成年BALB/c小鼠,體重22-24g,雌雄不限,由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供,并清潔級飼養(yǎng)。分組：假燒傷(Sham)組10只,實驗組40只,實驗組按燙傷后時間分為燙傷后2h、6h、12h和24h組。模型建立：小鼠用1%的戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉后,將小鼠背部備皮,盡量不傷及皮膚,硫化鈉去盡背部毛發(fā),背部脫毛區(qū)域大小4*4cm(約25%TBSA),將小鼠固定于操作板上。將小鼠背部脫毛區(qū)域置于97℃熱水中燙傷15秒(導致25%Ⅲ度燙傷創(chuàng)面),燙傷后立即腹腔注射0.9%無菌生理鹽水1ml抗休克處理,創(chuàng)面使用碘伏消毒后,再無菌紗布包扎。根據(jù)時間點行眼部取血,并提取血液中的白細胞,最后用Real-time qPCR法檢測小鼠燒傷后白細胞中Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun mRNA的表達情況。[研究結(jié)果]1.以MM-GAPDH為內(nèi)參,我們使用熒光定量PCR技術檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Lck mRNA的相對表達量。以sham組為對照,小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Lck mRNA相對表達量(x±s)如下：0.817±0.108、0.644±0.186、0.369±±0.120、0.536±0.131,各組與對照組相比較,組間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,小鼠燙傷后Lck mRNA的表達量在12h處于較低水平,在燙傷后24h內(nèi)整體表達下降趨勢。2.以MM-GAPDH為內(nèi)參,我們使用熒光定量PCR技術檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Stat-1 mRNA的相對表達量。以sham組為對照,小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Stat-1 mRNA相對表達量(x±s)如下：0.780±±0.127、0.527±±0.136、0.338±0.157、0.219±0.110,各組與對照組相比較,組間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,小鼠燙傷后Stat-1 mRNA的表達量在24h處于最低水平,在燙傷后24h內(nèi)整體表達持續(xù)下降趨勢。3.以MM-GAPDH為內(nèi)參,我們使用熒光定量PCR技術檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Myd88 mRNA的相對表達量。以sham組為對照,小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Myd88 mRNA相對表達量(x±s)如下：1.498±0.114、1.399±0.082、1.433±0.160、1.434±0.200,各組與對照組相比較,組間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,小鼠燙傷后Myd88 mRNA的表達量在2h表達量明顯增加,在燙傷后24h內(nèi)表現(xiàn)出持續(xù)高表達。4.以MM-GAPDH為內(nèi)參,我們使用熒光定量PCR技術檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Stat-3 mRNA的相對表達量。以sham組為對照,小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Stat-3 mRNA相對表達量(x±s)如下：1.424±0.107、1.529±0.094、1.396±0.080、1.680+0.129,各組與對照組相比較,組間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,小鼠燙傷后Stat-3 mRNA的表達量在12h處于較高水平,在燙傷后24h內(nèi)整體表達上調(diào)。5.以MM-GAPDH為內(nèi)參,我們使用熒光定量PCR技術檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Jun mRNA的相對表達量。以sham組為對照,小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Jun mRNA相對表達量(x±s)如下：1.197±0.061、1.535+0.129、1.748±0.079、1.571±0.120,各組與對照組相比較,組間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,小鼠燙傷后Jun mRNA的表達量在24h處于最高水平,在燙傷后24h內(nèi)整體表達上調(diào)。l研究結(jié)論]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)小鼠白細胞中Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun mRNA表達情況與基因芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果相一致,這進一步證實了這些差異表達基因在應對燒傷刺激反應過程中發(fā)揮了重要作用。
【關鍵詞】：燒傷 刺激反應 基因芯片 生物信息學 蛋白互作網(wǎng)絡
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R644
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 第一章 序言19-24
• 參考文獻22-24
• 第二章 小鼠燒傷早期刺激反應相關基因靶標的篩選24-41
• 2.1 材料與方法25-29
• 2.2 結(jié)果29-34
• 2.3 討論34-37
• 參考文獻37-41
• 第三章 運用熒光定量PCR技術驗證靶標基因41-64
• 3.1 材料與方法42-48
• 3.2 結(jié)果48-55
• 3.3 討論55-59
• 參考文獻59-64
• 全文總結(jié)64-65
• 攻讀碩士學位期間成果65-66
• 致謝66-67

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1 史勤，王國榮，秦文華;硒致刺激反應兩例報告[J];中國工業(yè)醫(yī)學雜志;1995年01期

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本文編號：802532