本文關(guān)鍵詞：差異基因表達譜分析小鼠燒傷早期刺激反應(yīng)相關(guān)基因靶標

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【摘要】：研究背景燒傷,尤其是大面積燒傷后大量組織壞死、明顯的應(yīng)激、休克、感染和營養(yǎng)缺乏等反應(yīng),與后續(xù)的各種治療因素一起改變了機體免疫細胞和免疫分子所處的微環(huán)境,引起機體發(fā)生一系列的免疫學(xué)及病理生理學(xué)變化,以至于機體免疫功能紊亂的發(fā)生。隨著燒傷免疫功能紊亂(post burn immune dysfunction,PID)觀點的提出,燒傷免疫功能紊亂被認為是燒傷后引發(fā)嚴重感染、多器官系統(tǒng)功能紊亂甚至死亡的重要原因。雖然不斷發(fā)展的燒傷治療技術(shù)一定程度上改善了患暫的預(yù)后,但嚴重?zé)齻颊芩劳雎什⑽匆娒鳚窠档?無法得到根本改善的燒傷后免疫功能紊亂被認為是其主要的障礙。目前對于燒傷免疫方面的研究多是對免疫細胞(包括T細胞、B細胞、殺傷細胞和單核巨噬細胞等)、免疫因子(如TNF、IL-1和IL-6等)的作用機制或細胞凋亡、細胞死亡、感染和器官損傷等方面的研究,由于從單一的基因及因子的研究出發(fā)時很難解釋整個細胞或系統(tǒng)的變化的,因此我們需要從整體基因組層次全面了解燒傷后免疫功能的紊亂�；蛐酒夹g(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為此提供了可能,它從轉(zhuǎn)錄水平和DNA層面來了解燒傷后機體發(fā)生的病理生理學(xué)變化過程。生物領(lǐng)域的新技術(shù)(基因芯片、生物信息學(xué))、新的研究方法(功能基因組學(xué)、蛋白組學(xué))在臨床中逐步得到應(yīng)用,更新了醫(yī)學(xué)科學(xué)基礎(chǔ)。另外,醫(yī)療實踐以循證醫(yī)學(xué)為主,從基因、蛋白質(zhì)等大分子水平研究疾病的發(fā)病機制,對疾病進行預(yù)防、診斷和治療,目標是向特異性診斷、個性化治療發(fā)展。分子水平生物信息監(jiān)測設(shè)備(基因芯片、質(zhì)譜儀等)將成為醫(yī)療領(lǐng)域的新需求。此外,伴隨著生物信息學(xué)的飛速發(fā)展,出現(xiàn)了大量潛在的生物標記,其中一些可以用于疾病診斷和治療,這些生物標記物信息在臨床上應(yīng)用潛力是巨大的。如何將生物標記物應(yīng)用于臨床診斷、疾病風(fēng)險評估與開發(fā)新的藥物靶點等是研究的重點問題。2008年有關(guān)研究者利用生物信息學(xué)和基因芯片技術(shù)對創(chuàng)傷和燒傷后小鼠免疫細胞基因組分析中發(fā)現(xiàn)燒傷后可引起免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)等多方面的變化。2010年Lars H. Evers,Dhaval Bhavsar等人又已經(jīng)提出基因芯片從細胞整體基因組水平出發(fā),能為燒傷后免疫功能紊亂機制的研究提供新的思路及治療靶點。目前生物信息學(xué)技術(shù)和基因芯片技術(shù)應(yīng)用于燒傷方面已比較普遍,但研究大多是從實驗出發(fā)分析某一個細胞因子的基因表達情況,芯片所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)并未得到更好的利用,數(shù)據(jù)分析還處于初級階段的功能驗證分析,因此,目前需要對燒傷基因芯片所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)進行更深入的生物信息學(xué)方面數(shù)據(jù)的挖掘和分析,以期為燒傷診斷及治療尋找相關(guān)生物靶標。本課題組在前期通過對GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中一組小鼠燒傷后白細胞基因芯片的數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)燒傷后小鼠白細胞表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)過程、細胞過程、代謝過程、應(yīng)對刺激反應(yīng)等方面的紊亂,同時也證實了燒傷后免疫系統(tǒng)功能變化一直貫穿著燒傷的全程,其中在燒傷后第1天基因表達變化最為顯著,因此嚴重?zé)齻蟮漠惓２±砩碜兓�、并發(fā)癥的出現(xiàn)、不良預(yù)后的發(fā)生,可能取決于傷后早期機體對燒傷刺激信號的反應(yīng)。為此本實驗應(yīng)用生物信息學(xué)方法對小鼠燒傷后免疫細胞基因芯片數(shù)據(jù)進行進一步分析,篩選出燒傷后小鼠應(yīng)對刺激反應(yīng)過程中的差異表達基因,并分析差異基因的生物學(xué)特性,后續(xù)再通過動物實驗對所篩選差異基因進行驗證,以期了解燒傷后免疫細胞應(yīng)對燒傷刺激反應(yīng)變化過程的分子機制,為臨床上燒傷早期診斷及藥物治療靶點的篩選提供新方向。本實驗包括兩個部分：第一部分小鼠燒傷早期刺激反應(yīng)相關(guān)基因靶標的篩選[研究目的]利用生物信息學(xué)方法對小鼠燒傷早期免疫細胞差異基因表達譜進行分析,以期對小鼠燒傷后免疫細胞應(yīng)對刺激反應(yīng)過程的機制加以了解,為篩選出燒傷早期應(yīng)對刺激反應(yīng)相關(guān)治療靶標。[研究方法]1.基因芯片數(shù)據(jù)篩選：從NCBI的GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ge o/)進行基因芯片樣本篩選,樣本需滿足以下篩選條件：①燒傷動物模型,TBSA20%,Ⅲ度燒傷或燙傷；②燒傷或燙傷分組時間少于48小時；③樣本及對照數(shù)目大于3。最終經(jīng)過芯片質(zhì)量評估,歸類整理后發(fā)現(xiàn),由Lederer JA等提交的GSE7404(動物模型為小鼠,25%TBSA,Ⅲ度燒傷)數(shù)據(jù)集滿足以上篩選條件。我們從中選取燒傷后第1天組免疫細胞樣本數(shù)據(jù)進行分析,總共有8個樣本符合條件,其中4個為燒傷組,4個為對照組。本研究所需GSE7404數(shù)據(jù)是GPL 1261平臺Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array基因芯片,為全血游離白細胞基因芯片。2.基因芯片數(shù)據(jù)的處理：由于基因芯片平臺的差異、系統(tǒng)誤差的存在和后期計算的需要,我們對基因芯片數(shù)據(jù)進行分析之前,需要先進行預(yù)處理(pre-procession)。預(yù)處理的過程主要包括：數(shù)據(jù)過濾,去除異常數(shù)據(jù)和噪音數(shù)據(jù)；補缺失值,保證數(shù)據(jù)的完整性；對數(shù)轉(zhuǎn)換,以滿足正態(tài)分布的分析要求；標準化,糾正系統(tǒng)誤差,以發(fā)現(xiàn)真正的生物學(xué)變異。3.功能富集分析：在本次研究中,我們應(yīng)用GO-function數(shù)據(jù)包對基因進行功能注釋,以有效的處理GO功能中的冗余,使分析結(jié)果更加可靠精確。應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)對基因數(shù)據(jù)進行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因與基因組百科全書)是由日本京都大學(xué)和東京大學(xué)聯(lián)合開發(fā)的數(shù)據(jù)庫,KEGG通路富集分析是目前常被使用的芯片數(shù)據(jù)基因功能分析方法,它利用的數(shù)據(jù)是一些已經(jīng)研究清楚的基因之間的相互作用,即就是生物通路。本研究通過DAV ID數(shù)據(jù)庫所篩選刺激反應(yīng)相關(guān)差異基因,并選取刺激反應(yīng)相關(guān)差異基因進行KEGG通路富集分析后,選取與燒傷后免疫細胞刺激反應(yīng)相關(guān)通路。4.刺激反應(yīng)相關(guān)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析：將選取的免疫系統(tǒng)相關(guān)差異基因應(yīng)用DAVID進行基因ID轉(zhuǎn)換,將轉(zhuǎn)換的差異基因輸入到STRING9.1數(shù)據(jù)庫中,選取交互作用評分大于0.4(中等可信度)的互作關(guān)系構(gòu)建刺激反應(yīng)相關(guān)差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction network)。網(wǎng)絡(luò)分析及MCL子網(wǎng)絡(luò)聚類分析采用生物圖表可視化工具Cytoscape軟件進行.STRING數(shù)據(jù)庫(http://string.embl.de)是一個搜尋已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng),它不僅包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間直接的物理的相互作用,而且包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間間接功能的相關(guān)性。Cytoscape作為一個開源性網(wǎng)絡(luò)分析和可視化數(shù)據(jù)分析軟件,目前它可以將生物分子交互網(wǎng)絡(luò)與高通量基因表達數(shù)據(jù)和其他的分子狀態(tài)信息整合建構(gòu)可視化的分子交互作用網(wǎng)絡(luò),并且對大規(guī)模蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間相互作用、蛋白質(zhì)和DNA之間等交互作用的關(guān)聯(lián)性進行分析。5.統(tǒng)計分析方法：使用R3.01統(tǒng)計軟件進行芯片數(shù)據(jù)處理和分析,原始數(shù)據(jù)通過RMA(robust multiarray average)背景矯正和四分位數(shù)法歸一化處理后,對數(shù)據(jù)進行匯總從而獲取表達水平數(shù)據(jù)。最后采用配對樣本t檢驗和倍比法(fold-change,FC)獲取差異表達基因,差異基因需同時滿足以下條件：①p-value0.01;②|logFC|2。Gene Ontology(基因本體論)、KEGG通路分析和蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析采用超幾何算法和Benjamini-Hochberg法對數(shù)據(jù)進行矯正。[研究結(jié)果]1.基因芯片分析結(jié)果：在燒傷后第一天差異基因進行基因功能本體(GO)分析顯示,共有259個刺激反應(yīng)相關(guān)差異基因被選出,其中上調(diào)基因118個,下調(diào)基因141個。通過KEGG通路富集結(jié)果顯示前10個通路符合閾值要求并被顯著富集。主要為包括免疫系統(tǒng)相關(guān)通路(toll樣受體信號通路；B細胞受體信號通路；T細胞受體信號通路等)；細胞過程中的細胞生長與死亡相關(guān)通路(p53信號通路；細胞凋亡通路)：環(huán)境信息進程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路。其中差異基因富集最多、最顯著的為toll樣受體信號通路。2.刺激反應(yīng)相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析：在刺激反應(yīng)相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中共由226個節(jié)點,1232條邊組成,在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中位于中心位置并且與其他蛋白或基因具有最大互作關(guān)系的蛋白或者基因在生物學(xué)過程中具有更重要的意義。在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中我們發(fā)現(xiàn)Jun(Stress=67)、Stat1(Stress=67)、Bcl2 (Stress=56)、Stat3 (Stress=54)、Tlr2(Stress=47)、Myd88(Stress=45)、Jak2 (Stress=41)、Lck(Stress=40)、Hck (Stress=38)、Ptpn6(Stress=38) 10個基因位于網(wǎng)絡(luò)中心,具有最高互作關(guān)系。為了篩選出與刺激反應(yīng)過程相關(guān)的重要的節(jié)點基因,我們通過MCL分析方法對原始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行聚類分析,選取力度系數(shù)大于4.0,互作關(guān)系大于6的網(wǎng)絡(luò)模塊進行下一步分析。我們發(fā)現(xiàn)MCL分析總共有7個子網(wǎng)絡(luò)被選出。最后通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示：Lck(表達下調(diào))、Stat1(表達下調(diào))、Myd88(表達上調(diào))、Stat3(表達上調(diào))和Jun(表達上調(diào))5個基因不僅在原始網(wǎng)絡(luò)中具有最大互作關(guān)系,而且在MCL網(wǎng)絡(luò)模塊中處于中心位置。[研究結(jié)論]通過對小鼠燒傷后一天全血游離白細胞基因芯片分析我們發(fā)現(xiàn)Lck、Stat1、 Myd88、Stat3和Jun基因在燒傷早期應(yīng)對刺激反應(yīng)過程中可能發(fā)揮重要的作用,是潛在的生物靶標。第二部分運用熒光定量PCR技術(shù)驗證靶標基因[研究目的]通過動物學(xué)實驗來驗證小鼠燒傷后刺激反應(yīng)相關(guān)重要靶標基因。[研究方法]動物分組及燙傷模型建立：選取50只健康成年BALB/c小鼠,體重22-24g,雌雄不限,由南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,并清潔級飼養(yǎng)。分組：假燒傷(Sham)組10只,實驗組40只,實驗組按燙傷后時間分為燙傷后2h、6h、12h和24h組。模型建立：小鼠用1%的戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉后,將小鼠背部備皮,盡量不傷及皮膚,硫化鈉去盡背部毛發(fā),背部脫毛區(qū)域大小4*4cm(約25%TBSA),將小鼠固定于操作板上。將小鼠背部脫毛區(qū)域置于97℃熱水中燙傷15秒(導(dǎo)致25%Ⅲ度燙傷創(chuàng)面),燙傷后立即腹腔注射0.9%無菌生理鹽水1ml抗休克處理,創(chuàng)面使用碘伏消毒后,再無菌紗布包扎。根據(jù)時間點行眼部取血,并提取血液中的白細胞,最后用Real-time qPCR法檢測小鼠燒傷后白細胞中Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun mRNA的表達情況。[研究結(jié)果]1.以MM-GAPDH為內(nèi)參,我們使用熒光定量PCR技術(shù)檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Lck mRNA的相對表達量。以sham組為對照,小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Lck mRNA相對表達量(x±s)如下：0.817±0.108、0.644±0.186、0.369±±0.120、0.536±0.131,各組與對照組相比較,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,小鼠燙傷后Lck mRNA的表達量在12h處于較低水平,在燙傷后24h內(nèi)整體表達下降趨勢。2.以MM-GAPDH為內(nèi)參,我們使用熒光定量PCR技術(shù)檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Stat-1 mRNA的相對表達量。以sham組為對照,小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Stat-1 mRNA相對表達量(x±s)如下：0.780±±0.127、0.527±±0.136、0.338±0.157、0.219±0.110,各組與對照組相比較,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,小鼠燙傷后Stat-1 mRNA的表達量在24h處于最低水平,在燙傷后24h內(nèi)整體表達持續(xù)下降趨勢。3.以MM-GAPDH為內(nèi)參,我們使用熒光定量PCR技術(shù)檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Myd88 mRNA的相對表達量。以sham組為對照,小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Myd88 mRNA相對表達量(x±s)如下：1.498±0.114、1.399±0.082、1.433±0.160、1.434±0.200,各組與對照組相比較,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,小鼠燙傷后Myd88 mRNA的表達量在2h表達量明顯增加,在燙傷后24h內(nèi)表現(xiàn)出持續(xù)高表達。4.以MM-GAPDH為內(nèi)參,我們使用熒光定量PCR技術(shù)檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Stat-3 mRNA的相對表達量。以sham組為對照,小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Stat-3 mRNA相對表達量(x±s)如下：1.424±0.107、1.529±0.094、1.396±0.080、1.680+0.129,各組與對照組相比較,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,小鼠燙傷后Stat-3 mRNA的表達量在12h處于較高水平,在燙傷后24h內(nèi)整體表達上調(diào)。5.以MM-GAPDH為內(nèi)參,我們使用熒光定量PCR技術(shù)檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Jun mRNA的相對表達量。以sham組為對照,小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Jun mRNA相對表達量(x±s)如下：1.197±0.061、1.535+0.129、1.748±0.079、1.571±0.120,各組與對照組相比較,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,小鼠燙傷后Jun mRNA的表達量在24h處于最高水平,在燙傷后24h內(nèi)整體表達上調(diào)。l研究結(jié)論]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)小鼠白細胞中Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun mRNA表達情況與基因芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果相一致,這進一步證實了這些差異表達基因在應(yīng)對燒傷刺激反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用。
【關(guān)鍵詞】：燒傷 刺激反應(yīng) 基因芯片 生物信息學(xué) 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R644
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 第一章 序言19-24
• 參考文獻22-24
• 第二章 小鼠燒傷早期刺激反應(yīng)相關(guān)基因靶標的篩選24-41
• 2.1 材料與方法25-29
• 2.2 結(jié)果29-34
• 2.3 討論34-37
• 參考文獻37-41
• 第三章 運用熒光定量PCR技術(shù)驗證靶標基因41-64
• 3.1 材料與方法42-48
• 3.2 結(jié)果48-55
• 3.3 討論55-59
• 參考文獻59-64
• 全文總結(jié)64-65
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果65-66
• 致謝66-67

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1 史勤，王國榮，秦文華;硒致刺激反應(yīng)兩例報告[J];中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;1995年01期

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3 姜秋泉;兒童苯乙烯吸入刺激反應(yīng)78例臨床分析[J];浙江臨床醫(yī)學(xué);2004年07期

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本文編號：802532