本文關(guān)鍵詞：Prdm14基因在豬早期胚胎中的表達及作用研究

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【摘要】：早期胚胎發(fā)育是哺乳動物由受精卵開始到胚胎伸長且沒有與子宮建立組織聯(lián)系的游離階段。早期胚胎發(fā)育過程中,基因開始表達,并且同時受到調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一系列調(diào)控,例如發(fā)生DNA甲基化、組蛋白乙�；鹊南嚓P(guān)表觀遺傳修飾作用�；蛟谵D(zhuǎn)錄后也會受到調(diào)控,如細胞自噬和Micro RNA作用等。PRDM14(PR domain-containing transcriptional regulators 14)是PRDM(PR domain-containing)轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,這種轉(zhuǎn)錄因子同時具有促進和抑制基因表達的功能。研究表明,Prdm14基因會在早期胚胎發(fā)育過程中開始表達,持續(xù)到囊胚階段,并在囊胚階段后特異性表達于原始生殖細胞(PGC)。Prdm14基因在小鼠及人類物種中研究顯示其在調(diào)節(jié)基因表達、維持多能性、參與表觀重編程方面具有重要作用,尤其PRDM14可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A、DNMT3B結(jié)合,抑制其功能,使DNA維持低甲基化的狀態(tài),進而促進基因表達。因此,我們選取Prdm14基因作為主要研究內(nèi)容。豬是我國主要畜產(chǎn)品之一,由于其器官大小、生理特性與人類相似,因此豬也被廣泛用于器官移植和疾病動物模型的研究中,這使得研究豬的基本發(fā)育過程及基因調(diào)控也變得至關(guān)重要。但是對于Prdm14基因的研究在豬中還沒有任何報道,因此,本實驗選取豬為研究對象,利用PCR、熒光定量PCR及RNAi干擾技術(shù)來探究Prdm14基因在豬胚胎及成體的表達情況和對胚胎發(fā)育的影響,從而為Prdm14基因在豬這一物種中的功能研究提供基礎(chǔ),同時也為此基因在其他物種中的研究提供一個方法和方向。本實驗主要結(jié)果如下:1、通過在NCBI上查找豬源Prdm14基因m RNA的預(yù)測序列(XM_003125600.2),分別在不同位點設(shè)計3對不同引物,利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)對豬源Prdm14基因進行擴增。分別得到321bp、241bp和479bp的目的片段,與預(yù)測產(chǎn)物大小相近,將得到的產(chǎn)物回收后測序,并與預(yù)測序列比對,結(jié)果顯示所測序列與預(yù)測序列相似度達98%~100%。通過各種常見研究物種PRDM14蛋白氨基酸序列比對,發(fā)現(xiàn)豬源PRDM14蛋白與牛相似程度最高,達到88%,另外與人的相似度也達到81%,并且在鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域高度保守,預(yù)示蛋白會有相似的功能。2、使用q PCR方法檢測Prdm14基因在MⅡ卵母細胞和胚胎發(fā)育期間2細胞、4細胞、8細胞以及囊胚各時期及新生仔豬主要器官心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢和睪丸中的表達情況。結(jié)果顯示,在MⅡ時期Prdm14基因的表達量最高,在胚胎發(fā)育階段2細胞表達降低,且達到所檢測的發(fā)育時期的最低值,隨后表達量逐漸升高,持續(xù)到8細胞時期達到一個高峰,之后在囊胚階段表達有所下降。而在新生仔豬主要器官中Prdm14基因分布的研究中發(fā)現(xiàn),卵巢和睪丸中有較高表達,其他器官表達較少。通過免疫熒光染色技術(shù),可以在上述胚胎發(fā)育時期檢測到PRDM14蛋白的表達。3、利用si RNA干擾技術(shù),在早期胚胎進行胞質(zhì)注射小干擾RNA對Prdm14基因的表達進行干擾,檢測Prdm14在胚胎發(fā)育及對基因表達調(diào)控方面的功能進行研究。結(jié)果顯示,干擾Prdm14基因的表達后,囊胚總細胞數(shù)上無顯著差異,但是卵裂率及囊胚率有顯著下降,說明Prdm14基因的表達與早期胚胎發(fā)育相關(guān)。4、使用q PCR技術(shù)檢測干擾Prdm14基因后對多能性相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾Prdm14基因表達后,在4細胞時期,多能性基因Sox2和Oct4以及抗凋亡基因Bcl2的表達量都會有顯著下調(diào),但是促凋亡基因Bax的表達量無顯著差異。而在囊胚階段,多能性和凋亡相關(guān)基因的表達量均沒有顯著差異。說明Prdm14基因在豬早期胚胎的一定階段能調(diào)節(jié)多能性基因和凋亡基因的表達,進而影響胚胎的早期發(fā)育。5、通過使用q PCR的方法,檢測干擾Prdm14基因表達后在4細胞和囊胚階段對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果顯示,在4細胞時期會對Dnmt1的表達下調(diào),而對Dnmt3a和Dnmt3b表達量的影響無顯著差異。而且在囊胚時期,這些基因的表達量與對照組也無顯著差異。實驗證明,甲基轉(zhuǎn)移酶基因Dnmt1受Prdm14的調(diào)控,說明Prdm14基因?qū)ζ渌虻募谆癄顟B(tài)會產(chǎn)生調(diào)控作用,進而推測Prdm14對多能性基因及凋亡基因的調(diào)控是通過影響其基因的甲基化狀態(tài)實現(xiàn)的。Prdm14基因的表達可參與調(diào)控胚胎的早期發(fā)育。
【關(guān)鍵詞】：Prdm14基因 豬 胚胎早期發(fā)育 基因表達 RNAi
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S828
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 英文縮寫詞表12-13
• 前言13-14
• 第一篇 文獻綜述14-28
• 第1章 哺乳動物胚胎形成及過程中的轉(zhuǎn)錄和表觀調(diào)控14-19
• 1.1 胚胎形成14-15
• 1.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)15-19
• 第2章 PRDM14相關(guān)研究進展19-28
• 2.1 PRDM14的分子結(jié)構(gòu)和生化特性19-20
• 2.2 Prdm14/PRDM14的表達20
• 2.3 PRDM14確保小鼠naive多能性20-22
• 2.4 PRDM14參與hESCs核心多能性網(wǎng)絡(luò)22-23
• 2.5 PRDM14和表觀重編程23-25
• 2.6 PRDM14在外胚層細胞確定生殖細胞命運25-28
• 第二篇 實驗研究28-62
• 第1章 Prdm14基因的擴增與鑒定28-39
• 1.1 材料與試劑28-30
• 1.2 實驗方法30-34
• 1.3 實驗結(jié)果34-37
• 1.4 討論37-38
• 1.5 小結(jié)38-39
• 第2章 Prdm14基因在早期胚胎和組織中的表達情況39-49
• 2.1 材料與試劑39-40
• 2.2 實驗方法40-43
• 2.3 實驗結(jié)果43-47
• 2.4 討論47-48
• 2.5 小結(jié)48-49
• 第3章 siRNA干擾Prdm14基因后對胚胎發(fā)育的影響49-62
• 3.1 材料與試劑49-50
• 3.2 實驗方法50-53
• 3.3 結(jié)果53-59
• 3.4 討論59-61
• 3.5 小結(jié)61-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻63-74
• 導(dǎo)師簡介74-76
• 作者簡介及攻讀碩士期間發(fā)表論文76-77
• 致謝77

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