發(fā)布時(shí)間：2017-09-03 14:29

  本文關(guān)鍵詞：抗冷基因ZmRLK克隆，，功能分析及對玉米遺傳轉(zhuǎn)化的研究

  更多相關(guān)文章： 玉米 Zm RLK基因 功能驗(yàn)證 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 花粉管通道法 遺傳轉(zhuǎn)化

【摘要】：玉米是世界上種植最為廣泛的農(nóng)作物之一,需求量在不斷增長。因此提高玉米產(chǎn)量十分重要。而玉米產(chǎn)量受諸多生物及非生物脅迫影響,其中低溫脅迫是東北地區(qū)比較普遍的農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害,在玉米生長季節(jié),遇低溫冷害,會(huì)導(dǎo)致葉片失水萎蔫,光合作用降低,花粉活力減弱,影響玉米的產(chǎn)量。因此,創(chuàng)制抗冷玉米新種質(zhì)和培育玉米新品種就顯得尤為重要。本研究利用RACE技術(shù),以W9816為實(shí)驗(yàn)材料克隆抗冷基因Zm RLK,構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行功能驗(yàn)證。同時(shí)以玉米骨干自交系Y423為實(shí)驗(yàn)材料,對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化,并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法及花粉管通道法將抗冷基因Zm RLK轉(zhuǎn)入玉米基因組,獲得抗冷玉米新種質(zhì)。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.通過RACE(Rapid Amplification of c DNA Ends)技術(shù)克隆到完整的玉米抗冷基因Zm RLK的全長。測序結(jié)果表明:該基因的核苷酸序列為2028 bp,編碼675個(gè)氨基酸,分子量為166.4471 k Da,等電點(diǎn)為4.91。對Zm RLK的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明,其與高粱,谷子等的相似性達(dá)到80%以上。由此可見Zm RLK編碼一類進(jìn)化保守性蛋白。2.以p CAMBIA3301為基礎(chǔ)載體,分別以35S和UBI為啟動(dòng)子,成功構(gòu)建了抗冷基因Zm RLK的植物過表達(dá)載體p CAMBIA3301-35S-Zm RLK和干擾載體p CAMBIA3301-UBI-Zm RLK(+)-intron-Zm RLK(-)。3.將抗冷基因Zm RLK轉(zhuǎn)化擬南芥并進(jìn)行功能驗(yàn)證,結(jié)果表明過表達(dá)Zm RLK能提高植株對冷脅迫的耐受能力。4.優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明:當(dāng)重懸后菌液濃度為OD600=0.55時(shí),侵染時(shí)間為25 min,AS濃度為100μmol/L時(shí),轉(zhuǎn)化效率最高。分化培養(yǎng)基中當(dāng)NAA的濃度為0.5 mg/L、6-BA的濃度為0.5 mg/L時(shí),轉(zhuǎn)化再生率最高。5.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化(1)以玉米骨干自交系Y423幼胚為受體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染12000個(gè)幼胚。其中過表達(dá)載體p CAMBIA3301-35S-Zm RLK共侵染了6000個(gè)幼胚,經(jīng)3 mg/L雙丙氨膦篩選愈傷后,分化成苗2207株,分子檢測獲得89株陽性植株,轉(zhuǎn)化率為4.0%;干擾載體p CAMBIA3301-UBI-Zm RLK(+)-intron-Zm RLK(-)侵染了4000個(gè),篩選后分化成苗1845株,獲得121株陽性植株,轉(zhuǎn)化率為6.6%;空載體侵染2000個(gè),篩選后分化成苗693株,獲得31株陽性植株,轉(zhuǎn)化率為4.5%。(2)以玉米骨干自交系Y423體細(xì)胞胚胎[1]為受體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染了12000塊愈傷組織。其中過表達(dá)載體p CAMBIA3301-35S-Zm RLK侵染了7200塊,經(jīng)雙丙氨膦篩選愈傷,分化成苗946株,分子檢測獲得63株陽性植株,轉(zhuǎn)化率為6.7%;干擾載體p CAMBIA3301-UBI-Zm RLK(+)-intron-Zm RLK(-)侵染了3800塊,分化成苗343株,獲得20株陽性植株,轉(zhuǎn)化率為5.8%;空載體侵染了1000塊,分化成苗103株,獲得8株陽性植株,轉(zhuǎn)化率為7.8%。6.通過花粉管通道法將含有抗冷基因Zm RLK的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入玉米骨干自交系鄭58、昌7-2。收獲T0代植株共75穗,得到12530粒種子。其中過表達(dá)載體30穗,共5221粒;干擾載體27穗,共4706粒;空載體18穗,共2603粒。經(jīng)過田間2‰濃度的Basta篩選及分子檢測,獲得68株陽性植株,其中過表達(dá)載體27株,干擾載體21株,空載體20株,轉(zhuǎn)化率分別為0.52%,0.45%,0.77%。將T0代種子自交,獲得T1代種子。按照同樣方法進(jìn)行加代并檢測,目前已獲得T2代種子共2638粒。
【關(guān)鍵詞】：玉米 Zm RLK基因 功能驗(yàn)證 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 花粉管通道法 遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文縮寫表10-15
• 第1章 文獻(xiàn)綜述15-24
• 1.1 冷脅迫對玉米的影響及抗冷基因的研究進(jìn)展15-19
• 1.1.1 冷脅迫對玉米的影響15-16
• 1.1.2 抗冷基因及RLK的研究進(jìn)展16-19
• 1.2 玉米轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展19-23
• 1.2.1 玉米轉(zhuǎn)基因受體材料19-20
• 1.2.2 轉(zhuǎn)基因的基本方法20-23
• 1.2.3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展前景23
• 1.3 本研究的目的與意義23-24
• 第2章 ZmRLK的克隆、載體構(gòu)建與生物信息學(xué)分析24-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料24-26
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑24
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)菌種與載體24-25
• 2.1.3 培養(yǎng)基25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法26-35
• 2.3.1 冷處理26
• 2.3.2 總RNA的提取26-27
• 2.3.3 c DNA的合成27-28
• 2.3.4 引物設(shè)計(jì)28-29
• 2.3.5 目的基因的克隆29
• 2.3.6 目的片段回收與連接p MD18-T載體29-31
• 2.3.7 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化31-32
• 2.3.8 質(zhì)粒DNA的提取及分子鑒定32-34
• 2.3.9 測序34
• 2.3.10 植物表達(dá)載體構(gòu)建34
• 2.3.11 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備34
• 2.3.12 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及鑒定34-35
• 2.4 結(jié)果與分析35-44
• 2.4.1 ZmRLK基因的克隆35-37
• 2.4.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建37-38
• 2.4.3 大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的鑒定38-39
• 2.4.4 生物信息學(xué)分析39-44
• 2.5 討論44-45
• 2.5.1 抗冷基因ZmRLK44-45
• 2.5.2 表達(dá)載體的構(gòu)建45
• 2.6 小結(jié)45-47
• 第3章 抗冷基因ZmRLK的功能驗(yàn)證47-61
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料47-48
• 3.1.1 菌種與載體47
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及儀器47
• 3.1.3 培養(yǎng)基47-48
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法48-53
• 3.2.1 農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥48-49
• 3.2.2 轉(zhuǎn)化植株抗性篩選49
• 3.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的檢測49-51
• 3.2.4 冷脅迫處理51
• 3.2.5 生理生化指標(biāo)的測定51-53
• 3.3 結(jié)果與分析53-59
• 3.3.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選53
• 3.3.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的分子鑒定53-56
• 3.3.3 冷處理56-57
• 3.3.4 生理生化指標(biāo)的測定57-59
• 3.5 討論59-60
• 3.5.1 抗冷相關(guān)的生理生化指標(biāo)59-60
• 3.5.2 擬南芥的種子萌發(fā)60
• 3.6 小結(jié)60-61
• 第4章 ZmRLK基因?qū)τ衩椎倪z傳轉(zhuǎn)化61-82
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料61-62
• 4.1.1 受體材料61
• 4.1.2 菌株和植物表達(dá)載體61
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑、藥品和儀器61
• 4.1.4 培養(yǎng)基61-62
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法62-66
• 4.2.1 幼胚的獲得62
• 4.2.2 體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)62
• 4.2.3 農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚62-63
• 4.2.4 遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化63-64
• 4.2.5 農(nóng)桿菌侵染玉米體細(xì)胞胚胎64
• 4.2.6 DNA提取64
• 4.2.7 分子檢測64
• 4.2.8 熒光定量檢測64-66
• 4.3 結(jié)果與分析66-80
• 4.3.1 遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化66-71
• 4.3.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化71-76
• 4.3.3 DNA提取76
• 4.3.4 PCR檢測76-79
• 4.3.5 熒光定量PCR79-80
• 4.4 討論80-81
• 4.5 小結(jié)81-82
• 第5章 花粉管通道法轉(zhuǎn)化玉米的研究82-90
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料82
• 5.1.1 受體材料82
• 5.1.2 菌株和植物表達(dá)載體82
• 5.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑、藥品及儀器82
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法82-84
• 5.2.1 重組質(zhì)粒DNA的制備82-83
• 5.2.2 重組質(zhì)粒DNA的導(dǎo)入83-84
• 5.2.3 T0代轉(zhuǎn)化植株的Basta抗性篩選84
• 5.2.4 T0代轉(zhuǎn)化植株分子檢測84
• 5.3 結(jié)果與分析84-89
• 5.3.1 重組質(zhì)粒DNA的分子鑒定84-85
• 5.3.2 T0代轉(zhuǎn)化植株的Basta抗性篩選85-86
• 5.3.3 T0代轉(zhuǎn)化植株的PCR分子檢測86-88
• 5.3.4 轉(zhuǎn)基因種子的獲得88-89
• 5.4 討論89
• 5.5 小結(jié)89-90
• 第6章 全文結(jié)論90-91
• 參考文獻(xiàn)91-100
• 作者簡介100-101
• 致謝101-102

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李倩;抗冷基因ZmRLK克隆，功能分析及對玉米遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D];吉林大學(xué);2016年

本文編號：785561