本文關(guān)鍵詞：松樹PicW同源基因的克隆及抗凍功能分析

  更多相關(guān)文章： 美國花旗松 華北落葉松 抗凍蛋白 原核表達(dá) 熱滯活性

【摘要】：作為非生物脅迫之一的低溫因子,影響并危害植物的生長及其繁衍規(guī)模。探究植物抗凍分子機(jī)制,挖掘抗凍相關(guān)基因,對于植物抗逆遺傳改良,促進(jìn)植物更好的適應(yīng)低溫環(huán)境具有重要的意義。本研究基于課題組前期的研究,從兩個松樹樹種美國花旗松和華北落葉松中克隆出青桿云杉抗凍基因PicW的同源基因PmCAP和LpCAP,氨基酸一致率分別為77%和71%。PmCAP基因編碼區(qū)序列長為576 bp,預(yù)測其可編碼191個氨基酸,等電點為5.39;LpCAP基因編碼區(qū)序列長為687 bp,可編碼228個氨基酸,等電點為5.44。PmCAP、LpCAP和PicW均含有脫水素類蛋白特有的K片段重復(fù)單位,蛋白成分中含有大量疏水氨基酸如Lys、Ala、Thr等。二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋和無規(guī)則卷曲組分,蛋白空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好。將基因PmCAP、 LpCAP分別導(dǎo)入大腸桿菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)后,轉(zhuǎn)基因菌株在-5。C培養(yǎng)生長的半致死率時間介于50-54h之間,而對照組菌株半致死率時間為32 h；轉(zhuǎn)基因菌株在-20℃培養(yǎng)生長的半致死率時間介于38-41 h之間,而對照組菌株半致死率時間為25 h,并且LpCAP抗凍性好于PmCAP。進(jìn)一步提取純化抗凍蛋白,利用DSC法測定PmCAP和LpCAP抗凍蛋白的熱滯值分別為0.27和0.72,顯著高于參考組系牛血清白蛋白(BSA)的0.05。研究結(jié)果得出,克隆的兩個松樹基因均具有較好的抗凍性能,可以用作植物抗凍分子育種研究資源。
【關(guān)鍵詞】：美國花旗松 華北落葉松 抗凍蛋白 原核表達(dá) 熱滯活性
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S791.24
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-5
• 縮略詞表5-9
• 1 引言9-21
• 1.1 植物抗凍蛋白的研究9-14
• 1.1.1 植物抗凍蛋白10-12
• 1.1.2 植物抗凍相關(guān)蛋白12-14
• 1.2 脫水素蛋白的研究進(jìn)展14-16
• 1.2.1 脫水素蛋白的結(jié)構(gòu)特征14-15
• 1.2.2 脫水素的功能及作用機(jī)制15-16
• 1.3 抗凍蛋白的研究技術(shù)16-18
• 1.3.1 熱滯活性測定16-18
• 1.3.2 冰晶形態(tài)分析18
• 1.4 研究目的和意義18-19
• 1.5 技術(shù)路線19-21
• 2 美國花旗松和華北落葉松PicW同源基因的克隆和生物信息學(xué)分析21-37
• 2.1 材料與方法21-26
• 2.1.1 實驗材料21
• 2.1.2 實驗方法21-26
• 2.1.2.1 植物DNA提取21-22
• 2.1.2.2 植物RNA提取22-23
• 2.1.2.3 目的基因的克隆23-24
• 2.1.2.4 目的片段回收24
• 2.1.2.5 目的片段與克隆載體連接24-25
• 2.1.2.6 大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化25
• 2.1.2.7 鑒定陽性克隆25-26
• 2.1.2.8 基因序列及蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析軟件26
• 2.2 研究結(jié)果26-36
• 2.2.1 火炬松基因組數(shù)據(jù)庫中PicW同源基因的鑒定26-27
• 2.2.2 美國花旗松和華北落葉松的PicW同源基因的表達(dá)模式分析27-28
• 2.2.3 美國花旗松和華北落葉松PicW同源基因全長的克隆28-30
• 2.2.4 PmCAP和LpCAP基因的生物信息學(xué)分析30-36
• 2.3 討論36-37
• 3 PmCAP和LpCAP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白提取純化37-45
• 3.1 材料與方法37-40
• 3.1.1 實驗材料37-38
• 3.1.2 實驗方法38-40
• 3.2 研究結(jié)果40-44
• 3.2.1 PmCAP和LpCAP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建40-41
• 3.2.2 PmCAP和LpCAP基因的轉(zhuǎn)化41-42
• 3.2.3 PmCAP和LpCAP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)42-43
• 3.2.4 PmCAP和LpCAP蛋白的純化43-44
• 3.3 討論44-45
• 4 PmCAP和LpCAP蛋白的功能分析45-53
• 4.1 材料與方法45-46
• 4.1.1 目的蛋白溶液配制45
• 4.1.2 PmCAP和LpCAP蛋白的熱滯值測定45
• 4.1.3 低溫下細(xì)胞存活率檢測與分析45-46
• 4.2 實驗結(jié)果46-51
• 4.2.1 PmCAP和LpCAP蛋白的熱滯值測定46-48
• 4.2.2 PmCAP和LpCAP基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌的抗凍性分析48-51
• 4.3 討論51-53
• 5 結(jié)論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 個人簡介61-63
• 導(dǎo)師簡介63-65
• 獲得成果目錄65-67
• 致謝67

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本文編號：776097