本文關(guān)鍵詞：松樹(shù)PicW同源基因的克隆及抗凍功能分析

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【摘要】：作為非生物脅迫之一的低溫因子,影響并危害植物的生長(zhǎng)及其繁衍規(guī)模。探究植物抗凍分子機(jī)制,挖掘抗凍相關(guān)基因,對(duì)于植物抗逆遺傳改良,促進(jìn)植物更好的適應(yīng)低溫環(huán)境具有重要的意義。本研究基于課題組前期的研究,從兩個(gè)松樹(shù)樹(shù)種美國(guó)花旗松和華北落葉松中克隆出青桿云杉抗凍基因PicW的同源基因PmCAP和LpCAP,氨基酸一致率分別為77%和71%。PmCAP基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)為576 bp,預(yù)測(cè)其可編碼191個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為5.39;LpCAP基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)為687 bp,可編碼228個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為5.44。PmCAP、LpCAP和PicW均含有脫水素類(lèi)蛋白特有的K片段重復(fù)單位,蛋白成分中含有大量疏水氨基酸如Lys、Ala、Thr等。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組分,蛋白空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好。將基因PmCAP、 LpCAP分別導(dǎo)入大腸桿菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)后,轉(zhuǎn)基因菌株在-5。C培養(yǎng)生長(zhǎng)的半致死率時(shí)間介于50-54h之間,而對(duì)照組菌株半致死率時(shí)間為32 h；轉(zhuǎn)基因菌株在-20℃培養(yǎng)生長(zhǎng)的半致死率時(shí)間介于38-41 h之間,而對(duì)照組菌株半致死率時(shí)間為25 h,并且LpCAP抗凍性好于PmCAP。進(jìn)一步提取純化抗凍蛋白,利用DSC法測(cè)定PmCAP和LpCAP抗凍蛋白的熱滯值分別為0.27和0.72,顯著高于參考組系牛血清白蛋白(BSA)的0.05。研究結(jié)果得出,克隆的兩個(gè)松樹(shù)基因均具有較好的抗凍性能,可以用作植物抗凍分子育種研究資源。
【關(guān)鍵詞】：美國(guó)花旗松 華北落葉松 抗凍蛋白 原核表達(dá) 熱滯活性
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S791.24
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-5
• 縮略詞表5-9
• 1 引言9-21
• 1.1 植物抗凍蛋白的研究9-14
• 1.1.1 植物抗凍蛋白10-12
• 1.1.2 植物抗凍相關(guān)蛋白12-14
• 1.2 脫水素蛋白的研究進(jìn)展14-16
• 1.2.1 脫水素蛋白的結(jié)構(gòu)特征14-15
• 1.2.2 脫水素的功能及作用機(jī)制15-16
• 1.3 抗凍蛋白的研究技術(shù)16-18
• 1.3.1 熱滯活性測(cè)定16-18
• 1.3.2 冰晶形態(tài)分析18
• 1.4 研究目的和意義18-19
• 1.5 技術(shù)路線(xiàn)19-21
• 2 美國(guó)花旗松和華北落葉松PicW同源基因的克隆和生物信息學(xué)分析21-37
• 2.1 材料與方法21-26
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法21-26
• 2.1.2.1 植物DNA提取21-22
• 2.1.2.2 植物RNA提取22-23
• 2.1.2.3 目的基因的克隆23-24
• 2.1.2.4 目的片段回收24
• 2.1.2.5 目的片段與克隆載體連接24-25
• 2.1.2.6 大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化25
• 2.1.2.7 鑒定陽(yáng)性克隆25-26
• 2.1.2.8 基因序列及蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析軟件26
• 2.2 研究結(jié)果26-36
• 2.2.1 火炬松基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中PicW同源基因的鑒定26-27
• 2.2.2 美國(guó)花旗松和華北落葉松的PicW同源基因的表達(dá)模式分析27-28
• 2.2.3 美國(guó)花旗松和華北落葉松PicW同源基因全長(zhǎng)的克隆28-30
• 2.2.4 PmCAP和LpCAP基因的生物信息學(xué)分析30-36
• 2.3 討論36-37
• 3 PmCAP和LpCAP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白提取純化37-45
• 3.1 材料與方法37-40
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料37-38
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 3.2 研究結(jié)果40-44
• 3.2.1 PmCAP和LpCAP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建40-41
• 3.2.2 PmCAP和LpCAP基因的轉(zhuǎn)化41-42
• 3.2.3 PmCAP和LpCAP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)42-43
• 3.2.4 PmCAP和LpCAP蛋白的純化43-44
• 3.3 討論44-45
• 4 PmCAP和LpCAP蛋白的功能分析45-53
• 4.1 材料與方法45-46
• 4.1.1 目的蛋白溶液配制45
• 4.1.2 PmCAP和LpCAP蛋白的熱滯值測(cè)定45
• 4.1.3 低溫下細(xì)胞存活率檢測(cè)與分析45-46
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-51
• 4.2.1 PmCAP和LpCAP蛋白的熱滯值測(cè)定46-48
• 4.2.2 PmCAP和LpCAP基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌的抗凍性分析48-51
• 4.3 討論51-53
• 5 結(jié)論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 個(gè)人簡(jiǎn)介61-63
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介63-65
• 獲得成果目錄65-67
• 致謝67

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1 周春娥;耿■;齊力旺;;梭梭膽堿單氧化物酶基因(CMO)的cDNA克隆[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年09期

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